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【求助】甲基化特异性PCR的修饰问题
【求助】甲基化特异性PCR的修饰问题
我做了三周的甲基化特异性PCR了,可用修饰完的DNA做模板,甲基化、非甲基化引物都扩不出来,而野生型引物确能扩出来,引物设计应该没问题,我现在高度怀疑是亚硫酸盐修饰有问题,不知用国产的亚硫酸氢钠和对苯二酚(北京化学试剂公司)可不可以?现在周围没有人能帮我,希望能得到任何做过MSP的人的指点,打电话也可以!急盼赐教!
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最新回复
wiwi (2016-3-03 16:05:21)
ququer787 (2016-3-03 16:06:32)
野生型引物能扩出条带来,是因为甲基化修饰不完全,修饰后的DNA中有野生型的DNA 。在进行MSP时往往要采用热启动PCR,使双链DNA充分解链,仅其中的一条链作为模板进行扩增。
newway (2016-3-03 16:06:50)
先谢谢你, 我正准备换用Sigma的产品,但又觉得同样是分析纯,国产试剂(新买的)应该可以修饰,即使是修饰的不完全,M或U引物也应有条带,我是完全按照Current Protocols in Human Genetics(1998) Herman 提出的方法做的,有用这个方法的同胞吗?是不是这个方法做msp 很难!马上要交课题总结了,急死我了!
newway (2016-3-03 16:07:21)
我用的是95度预变性5分钟,也是按文献上说的,不知是否可以使双链DNA充分解链?
你做过MSP吗?能否打电话向你请教一下?我真的很着急!
xevin (2016-3-03 16:07:39)
实在是劝你改用现成的试剂盒,如chemicon公司的,效果很好,价钱也不算贵,3000左右。可以做几十例呢,我们一直在用,到目前为止已经用到第三盒了。
newway (2016-3-03 16:08:54)
SO2 (2016-3-03 16:09:15)
cocacola (2016-3-03 16:09:31)
1、重新修饰。降低修饰的DNA的量(1-2ug就可以了);提高修饰的温度,约提高5度左右;也可以增加修饰的时间。当然能用试剂盒就更好了。
2、“如果修饰不完全,至少应该有少量的目的片段被修饰,这样以这些少量的DNA为模板,应该M或U引物也应该有条带呀?” 你所说的这个也很有道理的,所以你可以优化你的PCR,建议提高你的退火温度,延长退火与延伸时间(可以用45s--60s)
newway (2016-3-03 16:10:03)
2、醋酸铵的作用是中和反应体系中的碱,还有作为沉淀反应的盐,那么该如何确定其用量呢?
3、氢氧化钠再修饰的过程中用到两次,第一次起变性作用,机理是什么(怎么变性)?第二次是脱磺基作用,反应式是什么?
我想调整我的试验,但又不明白其中的细节,希望做甲基化的朋友能踊跃参加讨论,不知道在哪能找到这方面的知识?请大家给个提示!
3.14 (2016-3-03 16:12:39)
bongte (2016-3-03 16:12:57)
join (2016-3-03 16:13:52)
我觉得PCR体系倒不是重要的啊,操作就是照试剂盒的说明书一样啊,你先说说你的问题所在吧,是PCR扩后没带还是什么啊,你确定你的标本就一定是甲基化标本吗?
nn255 (2016-3-03 16:14:09)
sunnyB (2016-3-03 16:14:26)
还有就是你在加DNA模板的时候千万主意不要加进去沉淀(就是试剂III),另外不知道你在修饰的时候加试剂IV了没有啊,没有就最好加一下。
one (2016-3-03 16:14:43)
是否应该在用TE溶解后,再离心使试剂III沉淀后吸取。
我试试,回头告诉你结果
one (2016-3-03 16:14:59)
已经看到有目的条带大小的条带出来了,我想应该是吧,但是非特异的杂带也很多,今天重复设了模板和温度梯度可是目的带没有了,不知是怎么回事
ladyhuahua (2016-3-03 16:17:06)
给上面的朋友推荐一个好的实验方法论坛 protocol online论坛: 是美国华人所办,版主都是美国实验顶尖高手。有许多实验中的疑难问题的解决方法。尤其是甲基化实验。
cuturl('http://www.protocol-online.org/forums/index.php?showforum=6/')
49888 (2016-3-03 16:18:43)
cuturl('http://www.mdanderson.org/departments/methylation/dIndex.cfm?pn=A3F15D82-C9B4-41CD-BA4BE767E50A73D2')
woshituzhu (2016-3-03 16:19:26)
我知道这个网站,上面的protocol是手工修饰,我用的是试剂盒,昨天做出来的结果不错,带清晰背景干净,但是非甲基化也有大小相似的带出来(样本是甲基化的),怎么回事?
3648755 (2016-3-03 16:21:46)
我还没有完全明白,不过这里到是有这样的结果。文章见
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=1623846&sty=3&keywords=%BC%D7%BB%F9%BB%AF')
下面附件中标记处
这里的解释是标本4-6中既含有甲基化的等位基因,也含有未甲基化的等位基因。我的理解是标本的DNA经亚硫酸盐不完全处理,因为对于某一个个体的DNA,他/她的基因是否甲基化和/或甲基化的水平在一定情况下(比如你已经取到的标本中)是一定的。希望战友再给出确定的解释。
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