【求助】请教高手2D碱性端横纹的解决办法（附图）

最新回复

• ztonyc (2014-4-02 21:46:31)

  
  连中性pH区域都有这么多横条纹,所以先把这个问题解决了.
  不单单是碱性区域的问题,或者你的IPG是pH9-12的

• txwuyan (2014-4-02 21:48:00)

  谢谢楼上，用的3－10NL的胶条，的确，这些横纹从中性区就开始有，我用的Bio-Rad聚焦仪。而且单个的时候要好些。不知是什么地方出了问题，还请多各位朋友不吝指点。

• tie8 (2014-4-02 21:49:50)

  可能是DTT加多了

• txwuyan (2014-4-02 21:51:29)

  感谢你的提醒。我平衡是时的DTT配成0.1每5ml,按BIO-rad 上的说明加的，这样是否加多了，请问该加多少合适呢。

• ztonyc (2014-4-02 21:52:20)

  
  IAA才容易造成horizontal streak,DTT不会,多点没关系的了

• txwuyan (2014-4-02 21:52:42)

  
  楼上觉的我的胶IAAI少了吗，我的IAA是每5ml 平衡母液现加0.125g,欢迎讨论。

• PPT (2014-4-02 21:59:10)

  平衡时的DTT多点关系不大（我用的是0.1g/10ml平衡液），关键是聚焦时候的DTT，我的经验是不超过25mmol，多了就容易出现横纹。

• txwuyan (2014-4-02 21:59:39)

  
  聚焦时我的DTT浓度为65MMOL，是按操作说明的，以前也是这样，有时聚焦不很好。我查了文献我的情况和Amersham 上说的聚焦不足有些类似，但提高聚焦时间也未见明显好转。能能否和你单独交流一下

  
  36741068.jpg

• tudou85 (2014-4-02 22:00:19)

  
  不知道你的上样量是多少，上样量大比小横纹明显多，
  有没有用clean-up kit,
  样品来源是什么？
  RUNNING BUFFER是否干净?

• txwuyan (2014-4-02 22:01:43)

  
  上样量为200ug左右，在同样的上样量，有跑的好过，没有用过Clean-up kit,样品为大鼠肝样组织，经过匀浆。用超声去除核酸。

• jingling845 (2014-4-02 22:06:32)

  根据我的理解，横纹和平衡及二向是没有关系的，问题存在与一向聚焦
  碱性端的横条纹不是因为DTT多了，正是因为聚焦是DTT损耗导致碱性端DTT缺少所致，因此要改善这种情况，需要在碱性端Wicks上滴加20mM的DTT，我试过，挺不错的效果
  另外中间的条纹与样品有关，要么是一向聚焦不够或者聚焦过分，一般这种可能性不大；另外就是样品中盐离子较多，毫无疑问，这会导致出现横条纹；另外前两天我碰到的情况是聚焦完在冰箱里冻了一晚上，可能没有密封严实，结果第二天做二向后出现横条纹，同一批的另外六块胶没有任何问题，唯一的区别就是那六块没有冻直接做的二向
  希望能有用！
  好运

• txwuyan (2014-4-02 22:08:46)

  谢谢楼上的回复。我的聚焦后的胶条放在-20度过夜，不知是否是这影响结果。你的方法我会考虑的。

• @STAR@ (2014-4-02 22:09:04)

  
  聚焦后的胶条最好在-80度保存，但我想过夜问题不大.
  一般overfocusing发生在10W Vh后(你的10万KVh?!?!太吓人了)

• vvmmoy (2014-4-02 22:10:08)

  
  楼住的问题解决了吗?最近我也出了同样的问题,电压都很正常,DTT40mM,试了几次总是这样.

• greenbee (2014-4-02 22:10:28)

  
  水化上样Buffer里的DTT减少18mM。
  应该没问题。

• dreaming (2014-4-02 22:11:46)

  胶条放在-20度过夜
  我们的都放在-80度冰柜里。即使过夜，也还是小心一点按照常规放到-80度里的好。

• dreaming (2014-4-02 22:13:09)

  
  正好我手边有一份GE公司的2D实验技术手册，对照了一下，可能会对你有所帮助。想你所说的情况大概有4种原因可以引起。
  1，澎润Buffer液的调配不当，致使蛋白质没有充分被融入。2，蛋白质标本中有阻害IEF的不纯物质，改善方式是用Clean-Up Kit洗一遍。效果很好。3，蛋白质标本中混有过多的金属盐离子，改善方式同上。4，由于泳动时间过长（100000Vh以上），导致水和蛋白质的电离渗透发生，产生水平方向的条纹。
  具体情况你自己对照一下吧，不知道能帮得了你吗。

• sr9971 (2014-4-02 22:15:13)

  
  clean up真有那么神吗？
  现在手上倒有一个clean up kit，好像听说不是那么神

• sr9971 (2014-4-02 22:16:08)

  根据我的理解，横纹和平衡及二向是没有关系的，问题存在与一向聚焦
  碱性端的横条纹不是因为DTT多了，正是因为聚焦是DTT损耗导致碱性端DTT缺少所致，因此要改善这种情况，需要在碱性端Wicks上滴加20mM的DTT，我试过，挺不错的效果
  另外中间的条纹与样品有关，要么是一向聚焦不够或者聚焦过分，一般这种可能性不大；另外就是样品中盐离子较多，毫无疑问，这会导致出现横条纹；另外前两天我碰到的情况是聚焦完在冰箱里冻了一晚上，可能没有密封严实，结果第二天做二向后出现横条纹，同一批的另外六块胶没有任何问题，唯一的区别就是那六块没有冻直接做的二向
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  同意这位朋友的提法，在聚焦的时候ddt含量加多了会产生碱性端横条纹，因为我也曾遇到过类似的情况．在伯乐的网站上曾经看过一篇关于碱性端横条纹
  的文章，说法是因为ddt毫尽蛋白重新被氧化而产生横纹，还专门有相印的试剂盒解决这个问题，不过我个人遇到的问题也是因为聚焦时ddt加多了，后来把量改对了就没有横纹了