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【求助】跪求解答食用菌原生质体制备和融合的问题

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2016-3-08 10:09    作者: join    来源: 分析测试百科网

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【求助】跪求解答食用菌原生质体制备和融合的问题
本科和硕士都不是做真菌育种的，对这方面不是很清楚。
头回接触原生质体制备和杂交融合的问题，老师的意思是想挑平菇和秀珍菇进行杂交，
就想问一下：
1、能否传一份详细的类似真菌的原生质体制备的步骤
2、看了一些这方面的帖子，发现很多讨论说：不同真菌的制备方法不同，很多酶的量、温度要不断试验，问题是我连个参考也没有o(╯□╰)o
3、之前一位老师带着我做，我们都不大会，结果-----惨不忍睹，做了半天镜检连原生质体长什么样都不知道，于是俺有看了点资料，发现
有人说原生质体镜检要用暗显微镜还是神马的，普通光学显微镜不行，摔~~~~

如果给我步骤太麻烦，我把之前做的原生质体制备方法贴出来，大家帮我找找毛病也行，谢谢大家：

1、挑取4小块菌落放入液体培养基培养1周，取于液体培养基中的菌丝备用（一周都是静置培养，长在液体表面漂浮的菌落不用，原因不明o(╯□╰)o）
2、菌悬液倒入离心管
3、2500rpm离心15min
4、弃上清，沉淀中倒入0.6mol/l的甘露醇30ml，离心15min
5、弃上清，倒入甘露醇4ml，离心
6、弃上清，倒入溶壁酶(30ml水+0.15g蜗牛酶)
7、37°，3.5h(由于没有这种条件，所以选择水浴，不知道有没有影响o(╯□╰)o)
8、菌丝用装有脱脂棉的注射器过滤
9.过滤后得到原生质体，镜检
10、之后的融合还没做。。。。现有的仪器是CY-3型细胞融合仪
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最新回复

  • kswl870 (2016-3-08 10:10:00)

    过程没问题，就是你那个37度温度可能太高了，还有融合筛选你用什么做标记呢。。。。

  • join (2016-3-08 10:10:38)

    QUOTE:

    原帖由 kswl870 于 2016-3-8 10:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
    过程没问题，就是你那个37度温度可能太高了，还有融合筛选你用什么做标记呢。。。。
    抓住一个！别走啊啊啊
    融合了之后就涂布再生培养基吧，
    然后好像是到大棚进行出菇实验，其实我也不太懂不知道有没有别的好方法筛选

  • join (2016-3-08 10:11:01)

    蜗牛酶的温度？

  • 66小飞侠 (2016-3-08 10:11:22)

    关于原生质体，我认为你可以用1.5ml的甘油菌种管在水浴中试试，我是把离心管放绑在旋蒸仪上，让管中的液体充分混匀，然后才制出的。其实我原生质体做了8个月，最终以失败告终。我当时想着其关键在于管内的液体要充分混匀。还有，复苏培养基一定要加稳渗液

  • join (2016-3-08 10:11:53)

    QUOTE:

    原帖由 66小飞侠 于 2016-3-8 10:11 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
    关于原生质体，我认为你可以用1.5ml的甘油菌种管在水浴中试试，我是把离心管放绑在旋蒸仪上，让管中的液体充分混匀，然后才制出的。其实我原生质体做了8个月，最终以失败告终。我当时想着其关键在于管内的液体要充分混匀。还有 ...
    好的，谢谢~
    我试试~顺便问一下，你做出原生质体了，为神马叫以失败告终呢。。。。
    不是做出来了吗？是不是后期你又做融合神马的了。。。。

  • memory (2016-3-08 10:12:23)

    QUOTE:

    原帖由 join 于 2016-3-8 10:11 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    好的，谢谢~
    我试试~顺便问一下，你做出原生质体了，为神马叫以失败告终呢。。。。
    不是做出来了吗？是不是后期你又做融合神马的了。。。。
    我用的是EP管，很容易被水浴中的水污染，没有解决密封的问题，后来工作后发现有螺纹口的菌种管，密封性能较好，所以成功希望大。由于在制备原生质体上我花了太多时间，最后没有写进论文，放弃了，融合没有做。

  • join (2016-3-08 10:12:51)

    QUOTE:

    原帖由 memory 于 2016-3-8 10:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    我用的是EP管，很容易被水浴中的水污染，没有解决密封的问题，后来工作后发现有螺纹口的菌种管，密封性能较好，所以成功希望大。由于在制备原生质体上我花了太多时间，最后没有写进论文，放弃了，融合没有做。 ...
    谢谢你啊~
    不好意思啊，麻烦你能不能把你的步骤发给我啊(如果你有电子版的话)？
    我还没做出来呢，原生质体出不来，融合更别提了

  • TNT (2016-3-08 10:13:19)

    我找找看，不同菌种用的稳渗剂，消化剂，消化条件，还有复苏培养基都是不一样的。我觉得可以设计一套实验，加上显微镜观察，以确定最佳条件。我可以回去找找看我的方案，但是如果我的方法不适用，那么被我误导了就没办法了。

  • ladyhuahua (2016-3-08 10:13:42)

    楼主你好，我现在也准备做原生质体，楼主原生质体做的如何了呢？
    有一个很低级的问题想咨询一下，原生质体涂平板就用涂布棒涂布吗？会不会机械力太强把原生质体破坏掉？

  • join (2016-3-08 10:14:31)

    QUOTE:

    原帖由 ladyhuahua 于 2016-3-8 10:13 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
    楼主你好，我现在也准备做原生质体，楼主原生质体做的如何了呢？
    有一个很低级的问题想咨询一下，原生质体涂平板就用涂布棒涂布吗？会不会机械力太强把原生质体破坏掉？ ...
    你好，是做食用菌融合么，我在大型生产企业做菌种生产，希望能和你多交流学习

  • join (2016-3-08 10:15:37)

    楼主你好，我现在也准备做原生质体，楼主原生质体做的如何了呢？
    有一个很低级的问题想咨询一下，原生质体涂平板就用涂布棒涂布吗？会不会机械力太强把原生质体破坏掉？

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    还在不？
    你现在还做原生质体吗？
    涂布的时候是用枪吸到平板上，然后转一下平板让原生质体液均匀分散就行
    可以把你QQ告诉我不，我们交流一下
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