【讨论帖】关于重组蛋白生产用的细胞株构建与...

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• viviwang1987 (2016-4-09 16:41:05)

  1、可以出国读博士，毕业先到美国小的生物公司先做做
  2、国内做培养、发酵研发可以去公司的研发机构，大型反应器如果您不是女汉子，就别去。
  3、生物制药目前缺的是那种国际化的、有工作能力的年轻人，提高表达量、提高纯化收率、等给公司带来明确效益的，还有分析方法开发的人员比较抢手。
  4、去合资和外企，对于研发来讲比较好，如果你是一个事业型的女孩子，如果你满足于生活的悠闲，可以去研究所，据我所知，研究所往往没有生产型企业的研发搞的更实用，往往偏理论
  5、小企业或者是发展中的企业可以学习到很多，国外大企业也好，钱多，范围窄，适合没有太多追求的女孩子

• F22 (2016-4-09 16:44:22)

  经战友同意，将交流内容贴出
  你好，请问关于稳定细胞株所用载体问题：
  1、现在GS载体是否具有比DHFR有优势，相关专利大约什么时候到期？
  GS相对DHFR而言具有以下几点优势：
  1，细胞株筛选时间短，不需要不断的加压筛选。
  2，在细胞株稳定性问题上，GS系统要更加稳定，一般稳定性培养都要做到3个月左右时间。
  GS的专利好像还没有到期，DHFR的专利到期了。现在的筛选系统趋向于GS和DHFR双筛选系统，目的是集合两种优点，但效果还不确定。
  2、稳定细胞株在使用过程中的产量衰减问题是如何解决的，用大量的稳定细胞株长期加压筛选？
  细胞株克隆不稳定主要是克隆选择不好或筛选系统不好，主要偏向于前者。细胞株稳定性一般培养到两个月以后降低15%左右还是可以接受的
  3、如果采用定点整合载体，如何选择？
  这种方法目前常规用的可能比较少，在这方面没有经验的。一般GS或DHFR系统筛选到高表达细胞株克隆的概率是5%左右.

• glass (2016-4-09 16:44:49)

  各位大侠，我请教个很基础的问题（我主要做行政管理这一块），公司细胞培养这块的同事，每天去看发酵罐的次数也就2-3次，这个频率是不是少了点？而且主要的是细胞还养得不怎么样。
  
  
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  呵呵，看的次数多少和细胞养的好坏没有必然联系的
  所以做管理的不要从看发酵罐的次数来做判断，看的次数多少和你的管理工作没有关系，可以随他去
  细胞养得好不好才是你该关心的事情，养得不好可以说，可以提，但是不能从看多少次发酵罐来入手

• hustwb (2016-4-09 16:45:06)

  
  1、关于乳酸的控制控制有哪些比较好的策略，根据以往的经验就是就是降低糖浓度，结果是有的时候管用有的时候不管用，对于下面的工艺开发就比较头疼了。
  2、能否推荐一下关于反应器及工艺优化方面的介绍书籍，增加自己对这方面认识。
  再次谢谢您

• 米囡 (2016-4-09 16:45:24)

  
  1.我个人的经验的，反应器产量有了过程参数的精确控制（pH/DO/temp），流加方案的优化，关键代谢指标的控制（糖、乳酸、谷氨酰胺、氨），应该有较大幅度的提高（30%），当然这个是case by case的，不能一概而论，更多的依赖于细胞株潜力和平台化的培养工艺开发效率。
  2、培养基优化的常规方法与思路（参考《用于重组抗体生产的细胞大规模培养工艺开发》）
  3、不仅大豆水解物，还有小麦水解物，酵母水解物，肯定是要淘汰的。这些添加物本身成分不明确，质量不可控。培养基的发展方向是CD，即化学成分明晰。
  4、目前国内新上项目应该在2g/L左右。 如果不考虑具体的品种，市场容量对产能的要求。个人感觉4g/L没有必要。 重组抗体的产业化工艺开发不仅是细胞培养这一个环节。TITER过高对于下游的压力。对于产品质量的影响，都应该考虑。

• 米囡 (2016-4-09 16:45:43)

  
  1）控制乳酸，
  首先应考虑葡糖糖的限制性流加策略，即根据细胞的葡萄糖消耗速率进行培养基流加。考虑到葡萄糖浓度控制过低（<1g/L）时，培养基中其他营养成分可能消耗殆尽，一般残糖的控制水平可以控制在2-5g/L左右。
  目前商品化的培养基及流加策略，都有可供参考的protocal，可以直接在此基础上进行工艺优化。
  文献中报道的乳酸阈值（影响细胞生长、抗体质量的乳酸浓度）58mM，l流加培养操作模式下，一般很少能达到。
  其次，细胞培养工艺中pH的控制，对乳酸的生成也有影响。一般情况下，pH控制高，即偏碱的环境是刺激细胞产酸的。所以一般表达重组蛋白的培养工艺中，生产期的pH要控制的偏酸性。
  最后，溶氧不足也会造成细胞无氧呼吸，代谢产酸的。
  至于报道的使用半乳糖替代葡萄糖，不做推荐。
  2） 细胞培养的参考书籍
  推荐hu weishou 《Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies》google可以查到免费电子版本。

• yes4 (2016-4-09 16:46:03)

  学习了！另外询问一个问题，反应器中溶氧不足是培养过程中某个特定阶段的问题呢，还是会伴随整个培养过程一直出现？

• 米囡 (2016-4-09 16:46:31)

  以下是个人浅见，未必正确，仅供参考。
  1、溶氧需求是个变化的过程
  完整的细胞培养过程（无论batch、Fed Batch还是Prefusion）中溶氧的需求应该是一个变化的过程。
  因为，从细胞接种后，发酵罐的细胞总数、代谢活力会逐渐增加。此时耗氧量会逐步上升。当进入蛋白表达期后，通常由于降温的作用，细胞进入稳定期不再增殖，耗氧量日趋平缓，甚至下降。
  以上过程，如果使用三角瓶或简单的一次性反应器（如WAVE 20/50）批式培养，溶氧值的变化，会更为直观的体现出来：先下降后稳定，最后稍显升高。
  2、DO的绝对值不重要、DO的变化才是关键
  动物细胞对氧气的比消耗速率可以认为是个常数（当然也受代谢的影响），目前产业化流加培养的细胞密度1-2*10E7/ml，与微生物发酵的细胞密度相比（酵母、大肠等），存在数量级的差距。因此，一般情况下，溶氧的需求不是细胞大规模培养的限速步骤。对于灌注培养，虽然细胞密度相对较高（N*10E8/ml），溶氧需求也可以通过通入空气、氧气的混合气体来满足。
  以上这些，只要在发酵罐上设定溶氧控制范围，保证氧气钢瓶有足够的分压，便可通过反应器期内部的PID程序实现DO的精确控制（一般60~80%）。
  值得注意的，DO的剧烈波动会影响细胞的活性、产物的质量。前者是笔者有经验之谈。后者可见大量文献报道，DO对糖基化程度的影响。
  3、回到初始问题，培养过程中溶氧不足。我觉得是否可以先从反应器上找原因

• 米囡 (2016-4-09 18:01:46)

  经战友同意，公开问题：
  您好，我看了您的几个帖子，觉得您非常厉害，很是佩服。因为面临毕业找工作处于迷茫期，因此想请教您几个问题：
  1. 我14年硕士毕业，生物化学与分子生物学，女生。不知道我这种情况适不适合去工厂的细胞培养，主要是我是女生，觉得大型反应器应该是男生比较擅长。可能女生没有什么升职的空间。
  2. 在生物制药中有很多的环节，比如细胞，蛋白表达，纯化，您觉得做哪种工作更容易受到重视呢或更容易受到提拔（10年以后可以进入高层）
  3. 是去外企还是国内大企业还是去小企业比较好？我想象中大企业只能接触到某一小部分，小企业是不是可以学到更多的东西，不知道对不对。
  很期待您的解答，您的解答决定着小女子的方向。谢谢您。期待。。。。

• 星星点灯 (2016-4-10 16:08:59)

  
  三十年河东，三十年河西，对于不明确的培养基添加物只要不是动物的，目前还都能接受，CD未必是主流

• 星星点灯 (2016-4-10 16:09:32)

  经战友同意，公开问题：
  您好，我看了您的几个帖子，觉得您非常厉害，很是佩服。因为面临毕业找工作处于迷茫期，因此想请教您几个问题：
  1. 我14年硕士毕业，生物化学与分子生物学，女生。不知道我这种情况适不适合去工厂的细胞培养，主要是我是女生，觉得大型反应器应该是男生比较擅长。可能女生没有什么升职的空间。
  2. 在生物制药中有很多的环节，比如细胞，蛋白表达，纯化，您觉得做哪种工作更容易受到重视呢或更容易受到提拔（10年以后可以进入高层）
  3. 是去外企还是国内大企业还是去小企业比较好？我想象中大企业只能接触到某一小部分，小企业是不是可以学到更多的东西，不知道对不对。
  很期待您的解答，您的解答决定着小女子的方向。谢谢您。期待。。。。
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  1、可以出国读博士，毕业先到美国小的生物公司先做做
  2、国内做培养、发酵研发可以去公司的研发机构，大型反应器如果您不是女汉子，就别去。
  3、生物制药目前缺的是那种国际化的、有工作能力的年轻人，提高表达量、提高纯化收率、等给公司带来明确效益的，还有分析方法开发的人员比较抢手。
  4、去合资和外企，对于研发来讲比较好，如果你是一个事业型的女孩子，如果你满足于生活的悠闲，可以去研究所，据我所知，研究所往往没有生产型企业的研发搞的更实用，往往偏理论
  5、小企业或者是发展中的企业可以学习到很多，国外大企业也好，钱多，范围窄，适合没有太多追求的女孩子

• 45778 (2016-4-10 16:09:54)

  学习了！那这么看来，溶氧问题的解决一来要靠培养工艺的优化，二来要看反应器自身能否合理、高效的把溶氧分配均匀

• 987789 (2016-4-10 16:11:29)

  1. 我14年硕士毕业，生物化学与分子生物学，女生。不知道我这种情况适不适合去工厂的细胞培养，主要是我是女生，觉得大型反应器应该是男生比较擅长。可能女生没有什么升职的空间。
  个人觉得女生去车间做大型的细胞培养不适合，因为我们现在就在做1000L的生产，这样工作还是男生比较适合。
  2. 在生物制药中有很多的环节，比如细胞，蛋白表达，纯化，您觉得做哪种工作更容易受到重视呢或更容易受到提拔（10年以后可以进入高层）
  在细胞，蛋白表达，纯化这几个工作中，受重视程度没有差异的。做细胞培养方面平时加班多一些，我们休息的时候细胞没有休息。至于被提拔或进入高层要考自己的努力和周围的工作环境（同样条件元老身份的机会大一些）。
  3. 是去外企还是国内大企业还是去小企业比较好？我想象中大企业只能接触到某一小部分，小企业是不是可以学到更多的东西，不知道对不对。
  如果你有这样的心志建议你去小公司里发展，这样的机会多些；稍微大一点公司里部门结构基本成熟，学的东西比较局限提拔的机会也少（除非你能力非常的强）。最后说明一下，小公司风险大机会多大公司反之，最后在于你选择。

• 米囡 (2016-4-10 16:11:51)

  你好，请问关于稳定细胞株所用载体问题：
  1、现在GS载体是否具有比DHFR有优势，相关专利大约什么时候到期？
  2、稳定细胞株在使用过程中的产量衰减问题是如何解决的，用大量的稳定细胞株长期加压筛选？
  3、如果采用定点整合载体，如何选择？

• 米囡 (2016-4-10 16:37:04)

  看了您发表的“用于重组抗体生产的细胞大规模培养技术”这篇文章，真是受益匪浅，想有个问题请教您，对于一个全新的CHO细胞株（公司引进），我想开发一种适合它的培养基，目前准备对几种常见的成分已知的培养基进行不同混合，然后再进行优化，筛选出最佳方案。还有一种策略就是选择目前市场上的一些商业化培养基进行筛选，前面一种方法肯定更费时费力，但是感觉优化的空间更大点，不知您的意见如何？还是有其他更好的筛选方法，谢谢！

• 米囡 (2016-4-10 16:40:35)

  您的问题非常具有代表性。就中小生物技术公司而言，对于重组蛋白药物开发的介入，往往是从获得稳定细胞系开始的。针对这种情况，笔者的个人建议是这样：
  1、首先应了解该细胞系的来源、背景。即宿主细胞的生长特性、重组细胞的构建流程。培养基的开发虽然可大幅提高表达水平。但是细胞系的营养需求、生产能力在细胞构建的过程中就已经决定了。这是一个“先天”和“后天”的关系。而且，宿主的营养需求、载体的抗性标记，以及细胞系生产能力与遗传稳定性，这些细节都能为后续培养基开发工作提供依据和思路。
  2、一般项目交接时，技术方会提供与细胞系配套的培养基。培养基若为对方定制产品，则很可能此该培养基已经是针对细胞系优化后的“个性化培养基”；如果培养基为商品化的通用型培养。则表明培养基尚有继续开发的潜力和必要。
  此时建议你两种策略：1）直接在培养基中添加营养成分（如水解物、IGF、INSULIN等），如liuzy1974所言，水解物是成本低廉、效果显著的营养添加物。2）针对该细胞系对市售成熟的培养基进行筛选（不推荐厂商，可直接google到）。这部分试验，在三角瓶中批式培养即可看出差异。若其中最优培养尚未达到优化效果。可考虑不同培养基进行混合试验。为减少试验次数、提高试验效率，可使用DOE软件进行试验方案设计。
  3、如果您有已知配方的一种或多种动物细胞培养。可在此基础上进行系统开发。参阅文章中的方法，可以针对特定细胞系开发其“个性化培养基”，也可以开发供多个细胞系共同使用的“平台化培养基”。

• 米囡 (2016-4-10 16:42:18)

  
  把以前回答战友的帖子，也放在这里：
  有一个问题请教各位，在国内的实际生产中，提高抗体产量、改善抗体质量更主要是依赖工艺优化呢，还是寄希望于细胞株、培养基的改良？或者更直白一点，药厂老总更青睐于手下人用哪种方式来优化抗体生产？
  请大家不吝赐教
  谈下自己的认识：楼主的问题很具代表性。无论是做biosimilar，还是其他重组蛋白药。大家最关心的是往往是三个方面, 蛋白表达量（title）、质量（quality），还有就是进度。
  1、Title，细胞培养过程中蛋白的表达量是由单个细胞的产物比生产速率（Qp），活细胞密度（IVCD）以及培养时间（Time）三者决定的。即 Title=Qp*IVCD*Time
  Qp代表的是细胞异源表达重组蛋白的能力，它是细胞系构建过程中初筛、复筛的主要技术指标。目前行业内能够用于产业化生产的细胞系，Qp一般可以达到20pg/cell/day以上。 构建的细胞是否能够达到这个水平，一般取决与空宿主、载体、筛选通量，筛选策略。
  IVCD活细胞密度和Time培养时间，一般是初筛得到的重组细胞进行培养基优化、工艺开发时，主要考察的指标。目前行业内细胞使用商品化的培养基（Gibico/hyclone等）悬浮细胞密度一般可达1-3*10E7/ml，生长期5-7day，维持期10day以上。此步为细胞培养的工艺开发，需要借助三角瓶、深度孔板、小型反应器等进行培养基筛选、工艺参数优化。
  所以，细胞的表达能力一般是细胞系构建工程中就已经决定了。而细胞的培养密度、培养周期则需要在培养工艺开发中进行优化。两者都做好了，抗体的产量自然就有了保证。
  接着谈下质量。
  抗体作为四聚体糖蛋白，其生物学活性有赖于其完整的结构和恰当的翻译后修饰。某种角度上说，重组抗体的工艺优化，尤其是做similar，质量比TITER更为重要。
  目前重组抗体的制备是采用动物细胞异源表达。其制备工艺中无论是克隆筛选、细胞培养还是纯化工艺都会都抗体的质量造成影响。克隆筛选的常用策略是根据蛋白表达量去挑选高表达克隆。这样就会造成表达水平高、但是存在质量变异的克隆会进入下一轮复筛。但是，在克隆筛选环节考察产物的质量，需要借助高通量的分析设备。细胞培养过程中无论是培养基、培养工艺（PH/DO/TIME），甚至搅拌桨的设计都会影响抗体的质量。另外，纯化、制剂过程中，涉及到的buffer条件不恰当也会造成蛋白聚体的产生。
  目前重组抗体工艺开发中，经常关注的几个质量指标有
  1、分子量，
  2、纯度，即，单体、大分子物质（聚体）、小分量物质（降解）的含量
  3、糖基化修饰（寡糖类型及分布，如GO/G1F/G2F/MAN5等
  4、等电点。

• baidukk (2016-4-10 16:43:47)

  经战友同意，将交流内容贴出
  你好，请问关于稳定细胞株所用载体问题：
  1、现在GS载体是否具有比DHFR有优势，相关专利大约什么时候到期？
  GS相对DHFR而言具有以下几点优势：
  1，细胞株筛选时间短，不需要不断的加压筛选。
  2，在细胞株稳定性问题上，GS系统要更加稳定，一般稳定性培养都要做到3个月左右时间。
  GS的专利好像还没有到期，DHFR的专利到期了。现在的筛选系统趋向于GS和DHFR双筛选系统，目的是集合两种优点，但效果还不确定。
  2、稳定细胞株在使用过程中的产量衰减问题是如何解决的，用大量的稳定细胞株长期加压筛选？
  细胞株克隆不稳定主要是克隆选择不好或筛选系统不好，主要偏向于前者。细胞株稳定性一般培养到两个月以后降低15%左右还是可以接受的
  3、如果采用定点整合载体，如何选择？
  这种方法目前常规用的可能比较少，在这方面没有经验的。一般GS或DHFR系统筛选到高表达细胞株克隆的概率是5%左右.

• prettygirl@ (2016-4-10 16:44:27)

  
  有没有涉及到抗体药物申报中，从一个项目开发开始，应该是一个什么样的流程，中间要注意哪些环节关键点：比如到了什么阶段生产需要某种检测的样品

• 刘白白 (2016-4-10 16:45:08)

  各位大侠，我请教个很基础的问题（我主要做行政管理这一块），公司细胞培养这块的同事，每天去看发酵罐的次数也就2-3次，这个频率是不是少了点？而且主要的是细胞还养得不怎么样。