蛋白质的Western blot印迹分析
一、原理
一个基因表达的最终产物是产生相应的蛋白，因此检测蛋白是测定基因表达的主要标志。
原理：Western Blotting 是将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳，对不同分子量的蛋白质进行分离；并通过转移电泳将凝胶上分离到的蛋白质转印至固相支持物上，用抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）与转印后膜进行杂交，使其与膜上的靶蛋白特异性结合；再与经过氧化物酶标记的二抗结合，最后用ECL试剂反应，经X线片曝光、显影等一系列反应，检测蛋白质等生物大分子。
二、方法
样品蛋白的制备
SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳 转膜 检测
三、样品蛋白的制备
1、原理：
蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理只有两个方面：
一是用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、 层析和结晶等；
二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使备组分分配于不同区域而达到分离目的，如电泳、超速离心、超滤等。
2、蛋白质制备的步骤
（1） 选择材料和预处理
（2）细胞的破碎及细胞的分离
（3）提取和纯化
（4）浓缩、干燥和保存
3、培养细胞中蛋白质样品的提取
提取细胞蛋白多是利用将细胞裂解、破碎、使蛋白质释放 的原理，在提取蛋白质的实验中要考虑到细胞裂解液的pH、去 污剂的类型和浓度，以及二价阳离子、辅助因子等因素，同时 为防止细胞内蛋白酶对蛋白质的降解，需在裂解液中加入蛋白 酶抑制剂。
3.1 实验材料
（1）器材： 冷冻离心机， 细胞刮，Tip头、1.5ml、 0.5ml 灭菌Ep管，碎冰。
（2）试剂：
① 细胞总蛋白裂解液（100ml）: 1×PBS 80ml，Triton100 1ml, 去氧胆酸钠0.5g, SDS 0.1g, 补 1×PBS缓冲液至 100ml。 ② PMSF贮存液（PMSF 17.4mg/异丙醇）： PMSF（苯 甲基磺酰氟）在水溶液中不稳定，应在临用前向不含PMSF的裂 解缓冲液中加入PMSF贮存液100ul,使其终浓度为0.174mg/ml。 （3）Hela 细胞
3.2 实验方法
（1） 洗涤细胞：选取细胞培养皿中培养的Hela细胞，由37℃ 取出后放入冰盘中，预冷。吸弃原培养液，用4 ℃预冷的 1×PBS洗细胞表面3～4次，除净培养基中的血清，并尽量吸弃 细胞培养皿中残余的PBS。
（2） 向培养皿中加入蛋白裂解液(100ul/60mm)，轻轻晃动， 使裂解液均匀铺于细胞表面。
（3） 冰浴30～60min，期间晃动3～4次。
（4） 用细胞刮子集中裂解液，收集入冰上预冷的1.5ml Ep 管 中， 4 ℃离心，12000g 20min.
（5） 小心吸取上清液入新的预冷管中（为避免反复冻融导致 蛋白降解，可按需要将其分装使用），-80 ℃保有存备用（可 保存1年）
3.3 注意事项
（1） 注意个人防护：PMSF严重损害呼吸道黏膜、眼睛及皮 肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收有致命危险。一旦眼晴或皮 肤接触了PMSF，立即用大量清水冲洗。
（2） 设立必要实验对照。
（3） 为防止蛋白降解，上述操作全部应在冰上完成。
（4） 所用离心机需要提前预冷。
（5）可于显微镜下观察细胸裂解的程度。
（6）吸取蛋白上清液时，注意不要把沉淀吸上来。
4、蛋白质的浓度测定——考马斯亮蓝蛋白定量法
考马斯亮蓝 G－250 法是比色法与色素法相结合的复合方 法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的常用方 法。 4.1 原理
考马斯亮蓝 G-250 在游离状态下呈红色，最大光吸收在 488nm；当它与蛋白质结合后变为青色， 蛋白质-色素结合物 在 595nm 波长下有最大光吸收。 其光吸收值与蛋白质含量 成正比， 因此可用于蛋白质的定量测定。 蛋白质与考马斯亮 蓝 G-250 结合在 2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十 分迅速；其结合物在室温下 1h 内保持稳定。
4.2 实验材料
（1）器材：分光光度计及玻璃比色皿
（2）试剂：
①0.5% mg/ml BSA 标准蛋白液：生理盐水配制，分装小管， 4℃保存。
②考马斯亮蓝 G-250 母液：称取考马斯亮蓝 G-250 100mg 溶 于 50 ml 95%乙醇，加入 100 ml 浓磷酸(W/V)。过滤， 4℃ 保存6个月。
③考马斯亮蓝 G-250 使用液（0.01%考马斯亮蓝 G-250 ）： 取考马斯亮蓝G-250 母液 15 ml，加蒸馏水稀释至 85 ml，临 用前稀释。
4.3 实验方法
（1） 稀释BSA标准品及制作标准曲线：用生理盐水将 0.5mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）标准蛋白液稀释成 0,1,2,4,8,10,12 ug/100ul
（2）上述每管中分别加入 1.5ml 考马斯亮蓝 G-250 使用液， 室温反应后测定 595 nm吸光度值(OD595)，依据所得数据制作 标准曲线。
（3）稀释待测蛋白样品：吸取细胞总蛋白样品 2 ul，加入 98 ul 水（总体积为 100 ul ）和 1.5 ml 考马斯亮蓝使用液，混匀 后室温反应3～5 min，测定OD595 。
（4）计算样品总蛋白含量(ug/ul)：根据标准曲线图，找出样品蛋白在图中的位置，并计算出蛋白含量。
4.4 注意事项
（1）制作的BSA标准曲线如不规律，应重新再做。
（2）如果待测样品浓度高（如组织提取物），可用生理盐水 稀释倍后测定；如样品浓度底，可适当增加样品体积及减少水 的体积。
（3）比色皿的清洁：由于测定液中含有考马斯亮蓝，使用过 的比色皿呈蓝色并蓝色不易被清水冲洗掉，需用无水乙醇先将 比色皿脱色皿脱色数分钟，而后分别用自来水、蒸馏水冲洗干净。
四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉
1、原理
各种蛋白质因所带的净电荷、分子量大小和形状不同面有不同 的迁移率。如果在电泳体系加入SDS，形成带负电荷长椭圆棒状 的蛋白质-SDS复合物。从而消除蛋白质原有的电荷和形体差异， 从而对蛋白质进行分离。 当对蛋白质样品做SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉分析时，要在样 品中加入含有SDS和B-巯基乙醇的样品处理液。
样品处理液中加入溴酚蓝染料，用于控制电泳的过程。
另外在样品液中加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时，使样品溶液可以沉入样品凹槽底部。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于用于灌胶的聚丙烯酰 胺的浓度和交联度。SDS-聚丙烯酰胺凝胶大多按双丙烯酰胺：丙烯酰胺为了1：29配制，实验表明它能分离大小相差只有3%的多肽。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉成功的关键之一是电泳过程中蛋白质 与SDS的结合程度。影响它们结合的因素主要有三个：
（1） 溶液中SDS单体的浓度 SDS在水溶液中是以单体和SDS-多 肽胶束的混合形式存，能与蛋白质分子结合的是单体。单体的浓度 与SDS总浓度、温度和离子强度有关。
（2） 样品缓冲液的离子强度 SDS-PAGE的样品缓冲液离子强度较 低，常为10～100mmol/L
（3） 二硫键是否完全被还原 只有二硫键被彻底还原后，蛋白质 分子才能被解聚，SDS才能定量地结合到亚基上，使蛋白质的相对迁移率和分子量的对数呈线性关系。
2、实验
2.1 实验材料
（1） 器材： 垂直电泳槽，稳压稳流电泳仪/电转仪，蛋 白变性用加热仪器，Tip头，Ep管，碎冰，注射器等。
（2）1.0mol/L Tip· (PH 6.8) HCl
（3）1.5mol/L Tip· (PH 8.8) HCl
（4）10%SDS室温保存：去离子水配制。
（5）10%过硫酸铵（保存）：提供驱动丙酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。由于过硫酸铵会缓慢分解， 应隔周新鲜配制。
（6）TEMED（N，N，N，N’-四甲基乙二胺）：催化过硫酸 胺形成自由基而加速丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合。 （7）5 ×Tris-甘氨酸电泳缓冲液（1000ml）：去离子水 500ml，Tris 碱15.1g，甘氨酸94g, 10%(W/V)电泳级SDS 50ml，补去离子水至1000ml。使用前做5×稀释 （8）4×蛋白质电泳上样缓冲液 （9）蛋白质预染Marker
2.1 实验方法
1、制备SDS-PAGE凝胶
（1）准备SDS-PAGE凝胶电泳用玻璃板夹板
（2）配制10% SDS-PAGE分离胶（15ml）
（3） 灌制分离胶
（4）立即用0.1%SDS液覆盖胶面（隔绝空气有助于凝胶 聚合，使凝胶面形成平直），室温放置约40min至分离胶凝固。
（5）配制5%浓缩胶4ml (可以与配制分离胶时同时进行)
（6）倒掉（吸附）0.1%SDS覆盖液，用去离子水冲洗分离 胶表面3～4次，以洗净未聚合的丙烯酰胺（避免在胶顶部 或玻璃夹板中留有气泡），并用吸水纸吸掉残留的液体。
（7） 将凝胶板重新垂直放置，轻轻加入5%积层胶液（注 意避免产生汽泡），插入样品梳，使液面至样品梳上标志位置，室温凝胶约40min.
（8）轻轻拔去梳子，撕去封玻璃夹板用透明带，将玻璃夹 板“凹”面紧贴紧电泳槽，两侧用夹子很好地固定在电泳槽上。用针头式注射注射器吸取电泳缓冲液轻轻冲洗点样孔，以去除未聚合的凝胶，待上电泳。
2、样品变性及电泳
（1）由 -80℃冰箱取出Hela细胞总蛋白样品，立即插入冰中（减少 蛋白降解）待其融化。
（2）吸取细胞总蛋白样品15 ul 加入0.5 ul EP管中，每样品管中分 别加入5ul 4×蛋白质凝胶电泳上样缓冲液，轻轻混合，98℃变性 8min（同时变性标准分子量Marker），立即插入冰中，涡旋数秒， 短暂离心。
（3）吸出变性蛋白液，贴紧加样孔上方，将样品轻轻加入凝胶孔 中。
（4）将电泳仪设置成稳压状态，接通电源，将电压调至100V使样 品通过浓缩胶（电压约8V/cm）。当染料进入分离胶后，将电压调 高到130V（约15V/cm）,继续电泳使染料至分离胶适当位置（4℃ 冰箱中进行电泳），结束电泳。
注意事项：
（1）设立必要的蛋白质分子量标志物。
（2）丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于 皮肤，其作用具有累积性，故称量时应带手套及口罩。
（3）不同厂家的SDS可引起多肽的迁移图谱变化较大，建议认 准使用某一试剂级别。
（4）一旦加入TEMED，应立即混旋并快速灌注入玻璃夹板。
（5）过硫酸铵会缓慢分解，应隔周新鲜配制。
（6）为保持电泳的平衡，在无样品孔中也应加入适量的4×蛋 白质电泳液。
（7）正确连接电泳连线正、负极方向（负极在上，正 极在下），经保证电荷由负极向正极流动。
（8）凝胶玻璃板要定期做硅化处理：用氯仿或庚烷配 成5%二氯二甲硅烷溶液，用其浸泡或擦拭玻璃板，有机溶剂挥发时，二氯二甲硅烷即沉积在玻璃制品上。使用前用水反复冲洗多次或于180℃烘烤2h。
五、转膜
凝胶电泳结束后，将凝胶上分离到的蛋白条带通过转移电 泳方式转印至固相支持物上，然后分别用非标记一抗及二级 免疫试剂对其进行孵育、检测。
用于印迹法的固相支持物有多种，硝酸纤维素膜、尼龙膜 及PVDF膜较为常用。下面是介绍PVDF（聚偏氟乙烯）膜作为 固相支持物。 转膜的方式有湿转和半干转，下面介绍的湿转方法。
1、实验材料
（1）器材： 转移电泳仪，转仪电泳槽，PVDF膜，剪刀，滤 纸等。
（2）试剂：
①转移缓冲液：Tris 3.03 g，甘氨酸 14.4 g，甲醇 200 ml， 补ddH2O至 1000ml，每次配完可用2～3次。最好现配现用。 4℃ 避光保存。 ②考马斯亮蓝染色液（100ml）：考马斯亮蓝 R-250 0.25 g， 甲醇 50ml ，乙酸 10ml，蒸留水 40ml。待考马斯亮蓝R-250 溶解，用Whatman 1号滤纸过滤，以去除颗粒状物质。 ③脱色液：乙酸 10% (V/V)，甲醇 50% (V/V)，H2O 40% 。
2、实验方法
（1）PDVF 膜及滤纸的预处理：剪裁与胶大小一致的 PVDF膜，将其浸入甲醇液中浸泡10 s（快速激活PDVF 膜），去离子水处理5min，1×转移缓冲液处理10min 以上。
（2）剪裁与胶同样大小的6层滤纸，用转移液缓冲液浸 泡后待用。
（3）取下电泳板，将其平置（使凹面玻璃板在下）， 小心取出夹板中的垫片及去掉上层玻璃板，切除多余凝胶，将含样品胶在蒸馏水及1转膜液中各漂洗一次。
（4）转膜： ①将样品胶与膜装入标有正、负极的转膜夹板中：由正 极侧开始，依次为海绵垫片→3层滤纸→PVDF膜→样品胶 →三层滤纸（排除气泡）→海棉垫片，扣紧转膜夹板， 放入含有转膜缓冲液的转移电泳槽中。 ②正确连接转移电泳连线，使电荷由负极向正极流动。 接通电源，恒压状态下，80V 转膜2 h（此操作在4℃冰 箱中进行） ③小心取出转移膜（用铅笔轻轻描出蛋白Marker带）， 在1×TBST液中漂洗两次。 ④将凝胶浸入考马斯亮蓝染色液中，检查蛋白转移是否 完全。
注意事项：
（1）开始转移时一定要检查电流大小。过高电流产生的热量 会导致转移失败，通常高电流是由于转移液配制不当造成的。
（2）低离子强度转移缓冲液可使用较高电压，而不会导致高 电流和过热，但转移过程中由凝胶中渗出的电解质可导致转移 缓冲液电导增加，缓冲能力降低。
（3）也可在恒流状态下以200mA转移2h。
（4）若转移中因凝胶变形发生条带扭曲或由于凝胶中电解质 渗出导致过热，可预先将凝胶在转移缓冲液中浸泡。
（5）使用预先染色的蛋白质分子量标准品或转移后将凝胶 染色，可检查转移是否彻底。
（6）对于较大蛋白质，较低的丙烯酰胺浓度可获得较好的 转移效果。
（7）对电转移来说，最常遇到的问题是目的蛋白质转移效 率低，转移效率可由转移后对凝胶或膜染色来进行观察。
六、检测
1、实验器材
（1）器材：摇床，避光盒，洗膜用平皿，X线片，X线片曝 光盒等。
（2）试剂：
① 10×TBST缓冲液：100 mmol/L Tris· (pH 8.0)， HCl 1500mmol/L NaCl，0.2% Tween-20，补水至1000ml，高 压灭菌，4℃保存，使用前稀释10倍。
② 5%脱脂奶粉（1×TBST配制）。
③ 一抗：羊抗Actin (使用前用1×TBST稀释200倍)。
④二抗：兔抗羊Ig G/HRP (使用前用1×TBST稀释2000倍)。
⑤ECL试剂盒。
2、实验方法
（1）封闭：将转移后的膜放入5%（W/V）脱脂奶粉中，室温、 摇床上缓慢摇动状态下封闭1h(或4℃过夜)
（2）一抗反应：①将一抗（羊抗Actin） 用1×TBST稀释200 倍)；②将封闭后的膜直接放入上述抗体中， 4℃反应过夜。
（3）洗膜：将反应膜放入平皿中，用1×TBST漂洗一次，继 而用1×TBST洗涤3次（室温下缓慢摇动洗涤）以洗净未结合 的一抗，每次换入新液洗涤10min。
（4）二抗反应：①将二抗（兔抗羊 Ig G/HRP ）用1×TBST 稀释2000倍；②将经一抗作用过的膜放入上述二抗液体中 （室温、避光缓慢摇动）作用50min(不超过60min).
（5）洗膜：用1×TBST洗膜，方法同（3），洗去二抗。
（6）曝光及洗片： ①按1:1（V/V）混合ECL试剂盒中两种液体，在辣根过氧化物 酶（HRP）催化下，过氧化物酶与 Luminol 增剂反应发强光， 可见信号可以用压片法检测。Western 实验中，HRP标记在二 抗上，与一抗靶蛋白复合物结合，再用底物进行发光检测。 ②将上述混合液均匀铺在PVDF膜表面，室温作用2min，抖掉 膜上液体，将膜用保鲜膜包裹（避免在膜的上面出现气泡） ③在暗室中（红光下），将X线胶片直接压于包裹后的膜上， 曝光适当时间。 ④将曝光后X光线片在清水盘中浸湿→显影液中显影→清水中 漂洗→定影液中定影 5 min（具体曝光时间及显影时间需根据 显影结果作出调整）。
注意事项：
（1）选择合适的一抗及二抗浓度。
（2）选择合适的封闭液。
（3）吸取ECL试剂时要注意更换Tip尖。两种试剂一经混合， 应在内使用。
（4）注意避光操作。
（5）应考滤ECL试剂的发光强度极其衰灭时间，因此请按说 明书及实验具体情况进行。
-
科技前沿
-
综述
