【求助】关于抗体纯化

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• sunnyB (2013-9-27 15:34:33)

  使配体固相化的不溶性化合物称为载体。用于亲和层析的理想载体应该具备下述特性：①高度亲水，使固相配体易于同水溶液中的相应结合物接近；②惰性载体，使载体的非专一性吸附尽可能小；③具有相当量的化学基团可供活化，并在温和条件下能与较大量配体连接；④有较好的物理化学稳定性．不易受周围条件(加PH、离子强度、温度、变性剂和去污剂等)的影响，⑤具有多孔的网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过而增加配体的有效浓度；⑥有良好的机械性能，利于控制层析速度，最好是均一的珠状颗粒。抗体纯化中常用的载体为琼脂糖凝胶，它是球状凝胶颗粒。球状琼脂糖凝胶获水能力很强，物理和化学性质比较稳定。它具有疏松的网状结构，可让分子量上百万的大分子产物自由通过。因此用琼脂糖载体制成的亲和柱不但可以较长期的反复使用，而且可以采用蛋白变性剂作为洗脱大分子物质及彻底洗涤吸附物质的洗脱液。缺点是琼脂糖经不起有机溶剂处理，也不能进行干燥(包括冷冻干燥

• kuohao17 (2013-9-27 15:35:20)

  如果偶联小分子的话，NHS-actived sepharose比较好，如果偶联大分子的话，CNBr-actived sepharose比较好，在上免疫亲和层析柱之前最好进行粗提。

• ukonptp (2013-9-27 15:36:45)

  
  protein A or protein G

• yhz1973 (2013-9-27 15:37:21)

  可以用多肽＋CNBr-actived sepharose， 来做亲和纯化。不用做粗提纯

• ssonglikihi (2013-9-27 15:37:58)

  
  纯化多抗可以用更便宜的方法，亲和层析可以最后考虑。精提很便宜，再继续走一下 protein A 或G 就够了，亲和介质贵，何必舍近求远。

• moonlight45 (2013-9-27 15:38:21)

  作为特异性抗体而言，最好是要用抗原-亲和层析柱来纯化，其效果要比protein A or G好的多，根据你的实验来，千万不要因小失大，如果你想得到一个好的结果，最忌讳的就是省钱。

• utt0989 (2013-9-27 15:39:01)

  
  我觉得还是把多肽和凝胶直接偶联做亲和纯化好，这样能选择到亲和力更强的更纯的抗体，而普通的抗体纯化包括蛋白a等都不如这个方法好，其实选择便宜的活化好的琼脂糖凝胶比蛋白A要便宜。活化的琼脂糖什么都可以，但是我觉得环氧活化的最便宜也最好用，也没有杂吸附，后处理也简单，不向CNBr-actived sepharose和NHS-actived sepharose还得把没有反应的基团封闭，比较麻烦。

• bgf5 (2013-9-27 15:39:27)

  
  谢谢各位献言,对我帮助很大.我需要得到的是特异性的抗体,越纯越好.

• jkobn (2013-9-27 15:40:01)

  
  如果是纯化IgG，你可用SPA sepharose CL 4B的柱子，此法比较简易，用不同 pH 的洗脱液可一洗脱不同IgG亚类。刚开始可用pH8.0的PBS，然后分别用pH6.0、pH4.0、pH3.0的枸橼酸（柠檬酸）缓冲液洗脱，效果还行。

• bgf5 (2013-9-27 15:40:23)

  SPA sepharose CL 4B是一种什么介质？（没用过，别见笑。

• ssonglikihi (2013-9-27 15:40:44)

  
  这就是葡萄球菌A蛋白（protein A）交联琼脂糖凝胶

• bgf5 (2013-9-27 16:03:45)

  还有个问题请教：我是否可以用免疫用抗原（半抗原）交联于CNBr-actived sepharose 4B 来进行抗血清的纯化？或是直接把小分子抗原挂在环氧活化的琼脂糖上纯化呢？在此先谢过。

• ssonglikihi (2013-9-27 16:04:24)

  
  可以，如果你用的是小分子抗原，要选择有手臂的预活化凝胶。

• pengke1983 (2013-9-27 16:04:44)

  NHS条件比较温和，使用特定的手臂适合小分子配基的暴露以提高载量；对于大分子蛋白配基，相比CNBr，NHS形成的化学键更稳定，配基脱落也更低。
  
  抗体纯化还是建议先采用Protein A，然后根据所得抗体的质量和要求，决定是否做特异免疫亲和。不少情况下，Protein A亲和得到的抗体已经可以满足要求了。
  虽然Protein A/G填料比NHS活化填料贵，但成本不能只考虑填料，表达蛋白配基（几毫克到几十毫克）的成本也需要考虑在内，从分子构建、表达和纯化，成本并不低。
  综合总的成本来看，一定是抗原特异亲和最贵，除非配基的来源不存在问题，也没有任何成本。