【求助】实时荧光定量结果分析求助~~

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• mercedes (2015-3-10 17:30:23)

  模板是否降解，pcr条件还需优化，引物特异性如何？

• wu11998866 (2015-3-10 17:30:42)

  
  如果模板是基因组的话，扩20ul体系试试。一般模板是cdna的话，我们实验室一般用10ul体系。我用基因组做模板，用10ul体系很不稳定，后来改成20ul体系挺稳定。

• 王薇薇安 (2015-3-10 17:31:09)

  
  主要是引物的原因。除此之外，Mg离子浓度过高（最适浓度为2.0 mmol/L）、dNTP浓度过高（最适浓度200 uMol/L）、使用酶的质量、退火温度偏低都有可能产生非特异扩增。

• iii_ii (2015-3-10 17:31:28)

  主要是双峰吧？呵呵~~可以用特异性更强的酶试试~~

• huifeng0516 (2015-3-10 17:31:44)

  
  CT值是多少？做什么项目？引物是否已经BLAST

• october7 (2015-3-10 17:32:02)

  
  是否是有基因组的污染或者引物的污染

• rxcc33 (2015-3-10 17:32:20)

  
  基本上就上面的同道所提到的那些原因吧
  

• qiangren789 (2015-3-10 17:32:46)

  QUOTE:

  原帖由 wu11998866 于 2015-3-10 17:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  如果模板是基因组的话，扩20ul体系试试。一般模板是cdna的话，我们实验室一般用10ul体系。我用基因组做模板，用10ul体系很不稳定，后来改成20ul体系挺稳定。 ...

  我用的是CDNA为模板，非常感谢你的帮助，我想请问一下，为什么10ul的不稳定，20ul就能够稳定，有什么原因导致这种结果吗？

• qiangren789 (2015-3-10 17:33:09)

  QUOTE:

  原帖由 王薇薇安 于 2015-3-10 17:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  主要是引物的原因。除此之外，Mg离子浓度过高（最适浓度为2.0 mmol/L）、dNTP浓度过高（最适浓度200 uMol/L）、使用酶的质量、退火温度偏低都有可能产生非特异扩增。 ...

  我使用的是生工的PCR快速扩增试剂盒，这样的试剂盒有办法降低Mg离子浓度吗？

• qiangren789 (2015-3-10 17:33:35)

  首先，我没用过生工的PCR快速扩增试剂盒，如果你的扩增体系是MiX，你可以打电话或看说明书看一下Mg离子浓度是多少，一般产品都是2.5mM，你可以将全部配制好的PCR扩增体系进行稀释，稀释后使Mg离子终浓度降下来。举个例子：试剂说明书推荐体系为20 ul，稀释前Mg离子终浓度为2.5 mM，想要将Mg离子终浓度将为2.0，需加水X。即，2.5*20/(20+X)=2.0。算出X即是需加水的量。