【求助】western总出不来，想哭！

最新回复

• yychen (2013-12-20 23:34:03)

  
  几点建议：
  1. 你的actin没有，actin 应该是很好做的。考虑一抗、二抗是否匹配？
  2.目的蛋白提取方法是否合适？10-30ul样品中，你的目的蛋白能有多少？
  我们实验室，有人增加上样量达到200ug（总蛋白），所以蛋白提取方式和蛋白上样量是要考虑的问题。建议重新提取蛋白。
  3. 增加一抗、二抗孵育时间，都增加到2个小时。

• any333 (2013-12-20 23:34:23)

  
  谢谢指点！
  1、我的抗体匹配没有问题，我每次用前都仔细核对。
  2、最近考虑的问题集中在蛋白上。用BCA法测定浓度，非常高，8ul左右就有250ug蛋白。强烈怀疑，问过公司，回答试剂盒没有问题。估计蛋白液里的脂类比较多（用的组织是肝脏），导致吸光值增大。所以蛋白浓度真不好说。楼上有更好的方法吗？
  3、一抗我通常是过夜的，二抗我试试增加到2h吧。

• dreaming (2013-12-20 23:34:45)

  不知道你的组织裂解液里面含什么成份，最近我们的蛋白样用含有尿素、硫脲、CHAPS，这用BCA法测量浓度很是虚高！！
  不过我觉得你的问题应该不是这里，因为你转膜能在膜上看见条带，至少内参出来是没有问题，严重怀疑你的发光系统，换种方法？DAB？我觉得刚开始摸条件的时候用这种方法比较方便，就是有毒！
  还有你的抗体物种来源，不要说得这么肯定！！再看看你的说明书，贴在这里，有时候习惯思维的惯性，错了很久都不知道。
  但愿能尽快解决。

• any333 (2013-12-20 23:35:10)

  
  1.建议做一个普通的电泳，考染看看蛋白分离的情况以及蛋白量。如果都正常，再考虑下面的问题。可以发到版上来大家分析下。
  有一段时间我们也遇到出白片的情况，后来经分析发现是二抗的问题，你可以试一下二抗直接和底物作用后发光效果如何。
  还要考虑的是抗体的好坏，santa的抗体确实不保险，有很多就做不出来。 但是santa的actin是不错的。
  再有就是要注意有时候会由于未知原因出现荧光淬灭的情况，你最好去暗室把底物现加到膜上，在避光条件下看看是不是有开始有荧光条带，然后很快淬灭的情况。
  我们用的是perkin elmer 的二抗和底物。

• 33号 (2013-12-20 23:35:27)

  
  各位高手，我也碰上了同样的问题，已经做了近2个月，但是一点结果也没有，每次actin都会出现，但是总是锯齿状的，目的蛋白一直不出，大家帮忙分析一下吧，崩溃中......

• any333 (2013-12-20 23:35:46)

  
  actin能做出来可以说明实验系统没有大的问题，但是要做好比较微量蛋白的检测还是挺难的一个过程。很多实验室的系统都不一样，但是只要能做到准确灵敏就好。具体问题还需要具体分析啊

• hyuu (2013-12-20 23:36:05)

  
  同感！
  我也是用BCA法测蛋白，高的离谱！稀释后跑胶却发现总是出问题，各式各样的。整个系统没变啊，但用别人的蛋白测结果跑胶不错。
  很是郁闷啊，至今连转膜都没进行呐！！

• txwuyan (2013-12-20 23:36:55)

  显影系统是不是有些问题啊，先弄出张阳性的片子出来看看。胶片，显影液，二抗是否有问题。或者先不用ECL，而像楼上说的用DAB之类的试一试。

• any333 (2013-12-20 23:37:30)

  同感！
  我也是用BCA法测蛋白，高的离谱！稀释后跑胶却发现总是出问题，各式各样的。整个系统没变啊，但用别人的蛋白测结果跑胶不错。
  很是郁闷啊，至今连转膜都没进行呐！！
  
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  BCA法测定蛋白含量也是有限制因素的，含巯基乙醇的蛋白不能用这种方法测，所以你最好测一个裂解buffer的对照，看看是不是这种buffer里含有某些物质使BCA测试不准，如果这样的话你可以尝试用别的方法，比如氨基黑法等。另外，如果你只是要求上样量一致的话，可以先跑块胶，考染以后根据条带的深浅调整一下上样量，这要求你的眼睛判断比较准哦。

• jujuba (2013-12-20 23:38:04)

  谢谢指点！
  1、我的抗体匹配没有问题，我每次用前都仔细核对。
  2、最近考虑的问题集中在蛋白上。用BCA法测定浓度，非常高，8ul左右就有250ug蛋白。强烈怀疑，问过公司，回答试剂盒没有问题。估计蛋白液里的脂类比较多（用的组织是肝脏），导致吸光值增大。所以蛋白浓度真不好说。楼上有更好的方法吗？
  3、一抗我通常是过夜的，二抗我试试增加到2h吧。
  
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  BCA方法本身就有很多限制，很多去污剂，变性剂等浓度都有限制，高于限制基本就不可靠了，这个可以看pierce的说明书，上面说的很清楚。还有就是你的目的蛋白的色氨酸含量如何，如果很高，结果就很明显偏高了。
  western连内参actin都出不来，看来是实验问题了。

• glass (2013-12-20 23:39:33)

  
  是不是ECL不行，我原来做western，用博士德的ECL,很久都做不出来，因为目的蛋白表达很弱，后来经一位老师介绍，换了PIERCE 的supersignal的ECL，结果就出来了。而且条带很强。如果经济允许，就试一下，就是比较贵。

• seagate (2013-12-20 23:39:55)

  
  那有没有可能是蛋白抽提的问题呢？

• vcve (2013-12-20 23:40:13)

  
  内参都没有，建议
  蛋白要重新测定
  找个阳性蛋白
  是否是抗体问题，国产抗体一般不是很好，建议换个进口抗体试试
  上样系统有没有问题/

• koook5695 (2013-12-20 23:40:29)

  
  最近一个月都在做内参，按原来摸好的做出来的条件，但就是没有出来。上样量50ug，和别人跑同一块胶(用各自的蛋白样品)，所有条件都相同，除了一抗和二抗，结果人家出来了，我没出来，做了一个月了，崩溃啊……请大师们帮忙分析一下

• tudou85 (2013-12-20 23:41:27)

  
  定影液和显影液用了多久啊？？
  是不是应该要重配了？

• owanaka (2013-12-20 23:44:27)

  
  1 洗膜不要太剧烈，能把抗体洗下来
  2 洗膜时间不要太长，如果背景比较深，再调整时间、洗膜强度，必要时可以把某个背景深的膜单独多洗几遍
  3 一抗室温比四度容易结合
  4 二抗不用太长，1h足矣，一抗二抗是很容易结合的
  5 底物液不同品牌之间差异非常大，我用Millipore的，420，还能接受
  6 就是楼上提到的定影液和显影液了，不过这个影响不很大

• ha111 (2013-12-20 23:47:16)

  
  我们实验室已经淘汰掉曝光这种方法了，主要是曝光不易控制。
  一种用AP（碱性磷酸酶）标记的二抗孵育后，NBT/BCIP显色。特点是可以直接观察条带显出过程，容易控制，actin等好显的一类几秒钟就可以拿出终止显色，不好显的可以慢慢显，还可以把显色液稀释后4°显色过夜。显出后的条带直接扫描成像，背景深的晾干后背景会变浅。
  还有高级的，LI-COR Odyssey近红外扫描系统，用红外染料标记的二抗孵育后直接在机器上扫描成像，如果一条膜上有两个目的条带并且是属和兔两种抗性的，那么可以在这条膜上同时封上两种一抗，再用不同通道的鼠二抗和兔二抗同时孵育，扫描时可以一次性把两条带显出来，不同通道颜色不一样很容易区别。要是都是一种抗性的，不要紧，先敷一种一抗，显出来，还可以把显过的膜条Stripping掉（所用试剂也很好配），重新封闭再孵一抗再后续什么的，适用于珍贵样品同时条带位置很近。
  楼主问题：
  封闭用的牛奶用什么配的？有没有含TWEEN20，封闭时加这东西会增加背景。一抗二抗稀释时要加TWEEN20以降低背景。洗膜用的是什么？PBST还是TBST？其实效果差不多，但TWEEN浓度过高会使蛋白脱落，而且太酸太碱会影响抗体的结合。因为前面提到的Stripping试剂就是PH2.0，20min就能把一抗二抗都洗脱掉。至于发光显影，我没用过就不发表意见了。
  祝愿你早日解决问题！

• ha111 (2013-12-20 23:48:00)

  
  建议你找个做的好的师兄或师姐系统学习一下整个过程，与其自己浪费时间摸索实验方法，还不如直接向别人学习一下。这样或许能很快找到原因。

• finger (2013-12-20 23:48:22)

  
  我的建议 赶紧换掉santa的抗体！我是被他家的东西害惨了！

• DDD (2013-12-20 23:49:13)

  抗体很可能有问题！我也同意用二抗直接与发光剂作用，看有没有荧光的？？
  至于测蛋白含量，其实，每一次测含量的方法都是有其局限性的，组织裂解液里有去垢剂的话话，用RC DC试剂盒去测可能会更准确一点