查看完整版本请点击这里：
【求助】二维电泳样品处理中的一些问题，请教各位！
【求助】二维电泳样品处理中的一些问题，请教各位！
我目前刚刚开始做二维电泳，先打算只进行SDS-PAGE摸索一下样品处理的条件，有几个问题想请教各位：
1. 离心收集菌体后，加裂解缓冲液进行超声破碎，一般裂解缓冲液组分为尿素、DTT、CHAPS，与SDS-PAGE的上样缓冲液中的组分有一些相似，只是没有溴酚蓝，所以我比较疑惑超声破碎后的上清要进行SDS-PAGE时需要上样缓冲液吗？如果不需要，是不是就另外添加溴酚蓝即可啊？
2. 超声破壁的效果如何来判断？我看到园子里有一些帖子说是通过镜检，请问还有其他方法吗？
3. 如果我想测定破壁后样品液中的蛋白浓度，裂解缓冲液是不是会对测量结果有很大影响？怎么解决这个问题呢？
还请同在二维电泳领域奋斗的各位多提宝贵经验，谢谢！
查看完整版本请点击这里：
【求助】二维电泳样品处理中的一些问题，请教各位！
【求助】二维电泳样品处理中的一些问题，请教各位！
最新回复
tuuu2 (2014-2-14 10:48:49)
上样缓冲液中是需要SDS的，不然也不叫SDS-PAGE了。所以还是需要添加的。
超声破壁效果我觉得做一些预实验，跑胶看看也算是个法子了，对你定量也算是一个test了。细菌超声要控制好，有些菌的高分子量蛋白质容易降解。革兰氏阳菌壁厚比较难，超声次数多一些，阴菌还是相对好破的。
用你现在用的裂解液取超声上清后，用Bradford法测蛋白质浓度就可以了。你要做2D比较的话，只要样品一起定量，保证相对上样量一样多就可以了。
idea2011 (2014-2-14 10:49:34)
谢谢楼上战友的帮助啊！我再好好设计一下，希望有好一些的结果
我要争取在实验中多积累经验，现在还是个新手，只能求助于大家，希望以后也能解决其他战友的问题啊
lxh031 (2014-2-14 10:49:56)
请问楼主是做革兰氏阴性菌的双向电泳么？
如果是的话，咱们可就是名副其实的战友了，呵呵
对于你提出的问题，我仅就我积累的一点点经验做一下回答，希望对你的实验有所帮助。
1，裂解缓冲液与上样缓冲液的配方是不同的，裂解缓冲液里加了强变性剂尿素、硫脲等，这样就不用高温变性了，因为某些蛋白如果经过高温的话可能会降解掉；而上样缓冲液不需要这些强变性剂，加到蛋白溶液里后只需70度变性10分钟就可以直接上SDS-PAGE了。
因此建议楼主，如果要跑SDS-PAGE的话就用上样缓冲液溶解，如果要跑双向的话就用裂解缓冲液溶解。
2，超声破碎的程度不太好掌握，一般超声后溶液会比较清澈，能看到折射光，还有通过镜检，这个比较麻烦。
建议楼主掌握超声的时间就可以了，一般菌体大约超声10min就可以了。
3，裂解缓冲液里的很多成分比如说尿素、DTT都对bradford蛋白定量结果有影响，如果你想知道准确的蛋白浓度，可以买GE的蛋白定量试剂盒
（2D quant kit)，如果你只是想保证你用于上样的蛋白量一致的话，用bradford蛋白定量就可以达到目的。
望实验顺利！
tuuu2 (2014-2-14 10:50:25)
（2D quant kit)，如果你只是想保证你用于上样的蛋白量一致的话，用bradford蛋白定量就可以达到目的。
望实验顺利！
===============================================================================
bradford法对尿素、DTT是兼容的，对SDS是不兼容的，而BCA法对SDS是兼容的，对DTT是不兼容的。
huifeng0516 (2014-2-14 10:50:47)
QUOTE:
呵呵，不好意思哦，是我记错了，刚才又重新温习了一下相关知识。bradford蛋白定量法也就是考马斯亮蓝蛋白定量法不适用于存在其他能与考马斯亮蓝结合的试剂的情况，包括IPG buffer和chaps等；
BCA蛋白定量法也就是依靠铜离子的蛋白定量法不适于存在DTT和硫脲的情况。
2D quant kit是先将蛋白沉淀下来，依靠铜离子的还原反应来定量，可以很大程度上精确定量你所需要的蛋白。
idea2011 (2014-2-14 10:51:28)
最近在看帖时发现一个新的疑问：有关2D的上样量，如果是用考染的话需要500微克左右，这个应该是和胶的大小有关的吧？如果是7cm的小胶能分离这么多蛋白吗？
idea2011 (2014-2-14 10:54:01)
我的新问题已经得到解决了，呵呵 那么小的胶是分不了那么多蛋白啊 问了一个超级没水平的问题 真不好意思啊...看来还是得多看贴多看书啊 继续努力！
【求助】二维电泳样品处理中的一些问题，请教各位！