【求助】RNA 电泳出现4条带,不知道什么原因

字体: 小中大 | 打印发表于: 2015-9-04 17:42 作者: langlang 来源: 分析测试百科网

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【求助】RNA 电泳出现4条带,不知道什么原因

今天提RNA，跑电泳后感觉28s，18s，5s都不错，28s和18s都挺亮的，但就是在28s上面还有一条清晰的条带，不知道什么原因，用rna酶处理后所有条带消失，证明应该不是DNA污染，请高手指点？

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xue258 (2015-9-04 17:42:33)

不知楼主是如何确定28s，18s和5s的，是否有加Marker对照？还有楼主提RNA的材料是动物的还是植物的？如果是动物的，那确实有些奇怪；如果是植物叶片，那出现4条带是正常的，因为除了28s，18s，5s外，植物叶片中还有叶绿体RNA。不过这叶绿体RNA是在18S后面5S前面。如果真的如楼主所说是在28S前面而又会被RNase所降解，那这种现象确实有值得讨论的价值。
建议把图片贴上来，这样更容易判断。
qianqin1977 (2015-9-04 17:43:01)

绿色植物的RNA条带多了叶绿体RNA，有时还不止多一条。
是水稻叶片的RNA，除去28s，18s，5s，还有两条带！
langlang (2015-9-04 17:43:56)

我提的是动物的RNA，用的是QIagen的试剂盒，因为我看第二条带(可能是28s)比第三条带（可能18s）亮差不多1倍，第四条带（可能5s）可见但不是很清楚。第一条要比第四条清楚，比第二和三要弱些。
xue258 (2015-9-04 17:44:29)

还是建议把图贴上来，这样更加的直观，交流更加方便。还有能把哪种动物哪部分组织都讲得详细些吗，相信园内会有这方面的高手。
判断28S、18S，一般情况下是可以不用RNA Marker的，但你的情况真的比较奇怪。建议可以用RNA Marker做个参照，比如人的28S、18S的rRNA分别是5.0kb和1.9kb，老鼠的28S、18S的rRNA分别是4.7kb和1.9kb。
langlang (2015-9-04 17:45:14)

谢谢各位战友！
我提的是大鼠的肠道组织，图片在附件中

44475222.jpg
txwuyan (2015-9-04 17:47:09)

貌似28S部分降解形成，我以前也遇到过
xue258 (2015-9-04 17:49:46)

从图来看，确实很奇怪。看起来像是基因组或者是蛋白污染，但楼主说用RNase处理全部条带消失，所以我也不能确定哪一条是28S。
最直接的方法就是拿RNA Marker对照大小来判断。或者是把胶中的最上面的那一条带割胶，加入少量融胶液或者在低于55度下融胶，再加入少量RNase，然后电泳。如果电泳结果没看到任何条带，那应该就是RNA了。如果是RNA，那真的是很奇怪的现象，因为以前从来没有听说动物的组织RNA电泳有四条带的。如果电泳能看到条带，那应该是基因组污染或蛋白污染。
我知道的就只有这些了，祝实验顺利
vvmmoy (2015-9-04 17:50:16)

几种可能:
1.可注意RNA的降解：RNA部分降解的可能性很大，要求塑料耗材需要用DEPC浸泡过夜后高压灭菌。如果使用的是一次性的塑料耗材，可以直接高压灭菌用于实验。使用的蒸馏水需要配成0.1%DEPC水过夜后高压灭菌。操作过程，尽量不要交谈，可以不带口罩。
2.注意DNA或蛋白质的污染：细胞裂解后离心，取样时需要小心，只能取上清夜，如果取到中间层则可能引起DNA的污染。
RNA完整性的鉴定：一般我们使用的是琼脂糖凝胶电泳。由于我们使用的是公共设备，电泳槽及缓冲液中含有RNAase，所以需要用洗衣粉彻底清洗，并换新配置的TAE/TBE。否则会将电泳过程造成的讲解误认为是提取RNA过程中的降解。
dog002 (2015-9-04 17:50:44)

不对，那不是蛋白或DNA污染。
那一条带叫大分子RNA，常见于鼠组织。用RNA酶处理后会消失。
xue258 (2015-9-04 17:51:50)

请教一下楼上的，什么是大分子RNA？它是属于哪一类的RNA？谢谢！
shkudo (2015-9-04 17:53:39)

楼主能不能将所提取的RNA取一点65度保温5分钟，再与没保温的对比电泳一次，并且加上marker，用DNAmarker也可，注明胶浓度。
kulee (2015-9-04 17:53:56)

可能是RNA降解所致，我以前提取过水稻根系中的RNA，也出现过这种现象，后来换用新鲜样品后这种情况就消失了。我觉得样品降解的可能性最大，你可以找一些新鲜组织再做一下，祝顺利！
langlang (2015-9-04 17:54:22)

请教：65度5min，目的是什么呢？
woshi (2015-9-04 17:54:39)

我们做的大MICE的RNA也是这样,但RT做没有问题,也就没有深究,也很想知道为什么?
daod (2015-9-04 17:54:56)

大鼠是不是有什么病，有可能是病毒的基因组
也会不会是大的核酶一类的东西
如果很常见的话，那就不知道什么了
yonger (2015-9-04 17:56:03)

有些战友认为这是RNA降解所致，请问能否判断是什么 RNA降解的产物呢？
也许是基因组污染，但是你用的RNase质量不好，其中含有DNase，所以一处理结果就消失了
我也想问一下楼上建议的65度5min，目的是什么呢？
eric930 (2015-9-04 17:56:44)

觉得是RNA降解所至，建议从新实验一次
DCS (2015-9-04 17:57:37)

相关疾病：
先天性卵巢发育不全综合征
回答楼主和94520425，
照片上有6条带，4，5，6三条我认为是28s，18s，5s，而2，3通常也会出现，应为很弱（如a3）不被重视，分歧就在1带，RNase处理后1也消失，因此否定了我认为最大可能的基因组DNA，那么就可能是蛋白，但我想楼主操作时不会带入这么多蛋白吧（这点我不能肯定，因为b3、b4、b5亮度均高于a3、a4、a5，而b1却弱于a1），如果排除蛋白，那a1就可能是RNA的二级结构，不同构象电泳速率也是不同的。
65度保温5分钟后冰上急冷，RNA二级结构打开再电泳，就应该是三条带了。
愚之拙见，仅供参考。

35899944.jpg
veiwu (2015-9-04 17:58:03)

DNA污染是不是？？
xevin (2015-9-04 17:58:44)

建议楼主到下面的网址请教核酸抽提专家：Big Smile
核酸抽提：质量检测电泳照片的判读经验谈 (最好附照片) - 丁香园论坛
相信会得到更满意的答复