【求助】帮忙分析下PCR结果吧！

最新回复

• october7 (2015-1-14 16:51:23)

  
  都没有明显的条带出来，二号孔有一点。。不过算了吧。
  首先，要做对照。检验体系是否有问题。
  其次，有可能是菌落挑得太多，影响体系，回导致做不出来的。
  最后，不知道你的引物有没有问题，一般没问题的

• 小螺号 (2015-1-14 16:51:39)

  QUOTE:

  原帖由 october7 于 2015-1-14 16:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  都没有明显的条带出来，二号孔有一点。。不过算了吧。
  首先，要做对照。检验体系是否有问题。
  其次，有可能是菌落挑得太多，影响体系，回导致做不出来的。
  最后，不知道你的引物有没有问题，一般没问题的 ...

  对照是什么意思，是不是不加模版的对照，还是阳性对照？请不吝指教！

• luoliqiong (2015-1-14 16:51:54)

  
  你也把体系和程序附上来啊，这样咋分析O(∩_∩)O~菌液PCR不好做，可以提质粒再做啊

• 小螺号 (2015-1-14 16:52:22)

  QUOTE:

  原帖由 luoliqiong 于 2015-1-14 16:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  你也把体系和程序附上来啊，这样咋分析O(∩_∩)O~菌液PCR不好做，可以提质粒再做啊

  PCR 反应程序: 94 ℃× 5min
                      94 ℃× 1min -- 56 ℃×3 min--72℃× 3 min, n = 35 次
                      72℃× 10 min
  
  PCR反应体系为25μl:  
        PremMix   12.5μl
        上游引物        1μl
        下游引物        1μl
        模板              2μl
        水           补至25μl（8.5μl）
  请指教，谢谢！
  
  
  
  补充内容 (2012-7-17 15:50):
  目的条带为1468bp

• viviwang1987 (2015-1-14 16:52:42)

  
  从电泳条带来看，不知道你目的产物片段大约是多少，如果较大的话，那么最前面不到100bp的应该是引物二聚体，另外，可以把退火时间稍微缩短一下，模板加1ul试试看

• viviwang1987 (2015-1-14 16:52:58)

  对照是什么意思，是不是不加模版的对照，还是阳性对照？请不吝指教！
  
  --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
  
  可以做出来的对照~前提是你配置PCR反应体系的时候，是一起配置的，最后分成几份，才加进去DNA。。。这样的话，在同一条件下，若对照可以做出来，其他做不出来就可以判断不是体系有问题了，可以判断为：菌加太多，或菌落根本没有这基因。
  若对照也没做出来：可以判断体系出问题了~~即配置的溶液，你操作出问题等等或引物降解，或PCR参数出问题了~~所以做对照很好哟

• tuomu45 (2015-1-14 16:53:24)

  PCR 反应程序: 94 ℃× 5min
                      94 ℃× 1min -- 56 ℃×3 min--72℃× 3 min, n = 35 ...
  
  ===============================
  
  这个体系按照说明书，应该没问题的。。。

• 小螺号 (2015-1-14 16:53:50)

  PCR 反应程序: 94 ℃× 5min
                      94 ℃× 1min -- 56 ℃×3 min--72℃× 3 min, n = 35 ...
  
  ===============
  
  目的条带为1468bp

• 小螺号 (2015-1-14 16:54:09)

  从电泳条带来看，不知道你目的产物片段大约是多少，如果较大的话，那么最前面不到100bp的应该是引物二聚体， ...
  
  =================
  
  目的条带为1468bp

• shenkunjie (2015-1-14 16:56:14)

  QUOTE:

  原帖由 小螺号 于 2015-1-14 16:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  从电泳条带来看，不知道你目的产物片段大约是多少，如果较大的话，那么最前面不到100bp的应该是引物二聚体， ...
  
  =================
  
  目的条带为1468bp

  
  其实你的菌液鉴定结果应该基本都是阳性，Marker2000  1000--2000之间的若隐若现的带应该就是，但是目的带太弱了，二聚体太强，可以把引物的量减半，模板增加一些。试试、

• 小螺号 (2015-1-14 16:56:40)

  QUOTE:

  原帖由 shenkunjie 于 2015-1-14 16:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  
  其实你的菌液鉴定结果应该基本都是阳性，Marker2000  1000--2000之间的若隐若现的带应该就是，但是目的带太弱了，二聚体太强，可以把引物的量减半，模板增加一些。试试、 ...

  您好，我可不可以直接用PCR产物做模版，在跑一次PCR，谢谢！

• yjf1026 (2015-1-14 16:57:10)

  目的条带为1468bp
  
  ===========================================================================================================
  
  这样的话就可以肯定，你的目的片段没有P出来，给你两个建议：
  1、确认template的浓度以及纯度
  2、调整反应体系以及反应条件，做几个梯度看看，说明书上的都是理论的东西，实际操作过程中，会受到很多因素的干扰，所以说明书只能做一个参考，只有自己在实验过程中得到的数据才是最真实的。

• 小螺号 (2015-1-14 16:57:29)

  QUOTE:

  原帖由 yjf1026 于 2015-1-14 16:57 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  目的条带为1468bp
  
  ===========================================================================================================
  
  这样的话就可以肯定，你的目的片段没有P出来，给你两个建议：
  1、确认template的浓度 ...

  您好，您说的做几个梯度是指什么梯度？具体说下吧，谢谢！

• qhyu (2015-1-14 16:57:46)

  目标条带分子量有点大，可采用其他PCR产品

• 小螺号 (2015-1-14 16:58:41)

  QUOTE:

  原帖由 qhyu 于 2015-1-14 16:57 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  目标条带分子量有点大，可采用其他PCR产品

  其他PCR产品,能不能再指明点，谢谢！

• xue258 (2015-1-14 17:04:37)

  就是有些PCR试剂盒嘛~~最普通的只是1000bp以内，中等的是1000至3000bp，长的3000以上~~具体好像罗氏的也有~~高保真之类的。。。不过你先试试最普通的啦~~

• qiangren789 (2015-1-14 17:05:04)

  其实你的菌液鉴定结果应该基本都是阳性，Marker2000  1000--2000之间的若隐若现的带应该就是，但是目的带 ...
  
  =================================================================================
  
  不一定吧，如果我转化进感受态的话，假阳性是很多的~~那时郁闷死我，还好~~我只要一个阳性细菌就好了~
  

• u76mp (2015-1-14 17:05:31)

  一看跑出来的胶图片就知道你挑的菌落全部是阴性。。。。如果你的引物没有问题的话，还有模版加1微升就足矣！！

• yueban-1147 (2015-1-14 17:05:52)

  引物已经形成二聚体了，丢那星星

• qqq111 (2015-1-14 17:06:09)

  
  貌似全是引物二聚体呀