【求助】荧光定量溶解曲线双峰怎么办？

字体: 小中大 | 打印发表于: 2015-8-01 15:26 作者: fox_79 来源: 分析测试百科网

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【求助】荧光定量溶解曲线双峰怎么办？

各位大侠请帮忙看一下
我用SYBR Green法做相对定量PCR检测两个目的基因得表达，但是用ABI7500两步法扩增得到得溶解曲线都有双峰，并且将退火延伸温度从60度提高到65度重新跑后，溶解曲线双峰仍然没有消掉。
基因1的溶解曲线

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社会主义好 (2015-8-01 15:26:50)

一般的主峰前面出峰的话，是引物二聚体，而如果主峰后面出峰的话，一般的是非特异性的大片段的扩增。如果主峰相对强于次峰，可以通过改变引物浓度，退火温度和镁离子浓度来解决，但如果次峰强于主峰，就是说杂带的特异性高于目的条带，一般的只能换引物了。
不过从你的图上看主峰很强，你所谓的“双峰”不明显，我个人认为结果可以做分析用。不过值得注意的是你的溶解曲线的尾巴上，有往上抬的样子而不是平的，貌似有个干扰的大片段？建议把pcr产物跑个胶看看。
还有，你的目的片段也大了点，过300bp了吧？理论上100-200bp最好，不过300以上也没什么问题。呵呵呵呵，罗嗦了点。
fox_79 (2015-8-01 15:27:15)

十分感谢楼上得回答，我的目的片段是428bp，那我的主峰前面的小峰就是引物二聚体了，如果通过条件调整，把引物二聚体消掉的话，我的这对引物可以用来做实验吗？至于后面翘起来的尾巴，只要有翘起来的就都是非特异性扩增吗？那引物是不是就不可以用啦？我的电泳跑过了，没有十分明显的大片段杂带啊
还有一个基因，目的片段351bp,溶解曲线也一样有双峰，尾巴也翘起来了，请帮忙看看

74343985.snap.jpg
feiya (2015-8-01 15:27:32)

小峰也许是因为DNA污染呢？
tudou85 (2015-8-01 15:27:52)

如果琼脂糖电泳看了也没什么杂带的话
我认为你的引物二聚体也不是很明显，所以我认为这样的结果已经可信了，
可以不去管它了，直接取数据吧。
milkdog (2015-8-01 15:28:30)

那你就要考虑重新设计引物了。
DCS (2015-8-01 15:28:55)

你图上的小峰看似不是引物二聚体，而是二楼说的非特异性扩增。引物二聚体一般的Tm值在75～80度之间，在80度前的大多是引物二聚体。
关于溶解曲线最后的上翘，建议你贴张溶解曲线的原始图片（荧光信号对温度的曲线），最后的上翘可能是数据采集和处理的问题，你把溶解曲线的结束温度设置为95度，再看看原始图片，如果90多度原始曲线没有明显的斜率变化，应该就没有问题。
fox_79 (2015-8-01 15:29:21)

十分感谢诸位的帮助，这个是不是就是溶解曲线的原始图片呢？
基因一：

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fox_79 (2015-8-01 15:29:38)

基因二：

90356814.snap.jpg
S6044 (2015-8-01 15:30:28)

从这两张原始图片来看，溶解曲线最后的上翘是数据处理的问题，与你的实验结果无关，基因1的溶解曲线结束温度的设置最好提高到95度，曲线会漂亮些。
fox_79 (2015-8-01 15:31:02)

请教各位，那我的这两对引物可以用来试验吗？前面的小峰确定是非特异性扩增吗？下面是我的定量PCR产物电泳图，没有非特异片段，是不是可以认为非特异性扩增不明显而忽略呢。试验很急，这两个基因的引物是引用参考文献上的（本学科权威SCI）,因为TAKARA帮我设计时说因为基因内部重复序列太多，无法设计出合适引物。
从左到右：Marker----基因一----其他基因----基因二

93509342.jpg
伊莎贝拉 (2015-8-01 15:31:27)

主峰前有三个次峰，减低引物浓度提高退火温度可以吗？
13775112843 (2019-12-26 16:27:45)

从楼上的解释看都比较全面了，试剂盒也许也应该分析下，之前我师姐用BIOG跑双重PCR两条带都清清楚楚的，所以建议试下看看。