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肝癌
MTT原理、步骤、结果分析方法及注意事项。心血啊！！！！
MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。还原生成的formazan结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO来溶解。
MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。
MTT
步骤如下：
1：接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔
1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.
2:培养细胞：同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。
3：呈色：培养3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS <ph=7.4>配)20ul.
继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。
4：比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
注意事项：
（1）选择适当得细胞接种浓度。
（2）避免血清干扰：一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。
（3）设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。
MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系，
IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50％抑制率时候的药品浓度，就是IC50。要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可！
举个例子：各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入
计算公式：
Pm=0.95
Pn=0.06
P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1
Xm=lg0.1=-1
lgI=lg0.1/0.01=1
lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025
IC50=0.00025
有一个公式可供参考;
lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)
Xm:lg 最大剂量
I:lg(最大剂量/相临剂量)
P:阳性反应率之和
Pm:最大阳性反应率
Pn:最小阳性反应率
抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值
公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率
例：
用96孔板培养SMMC-7721肝癌做MTT测细胞活力,应该加多少1640培养基,多少MTT和DMSO合适?根据书上说的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加DMSO之前要尽量去掉培养液，便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定
一般每孔4000个细胞为宜，既细胞浓度在20000个/ml，MTT加20ul，作用四小时后洗掉上清液，注意不要将甲瓉洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脱色摇床上振荡10分钟，然后测吸光值
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最新回复
wawa (2015-8-12 16:52:19)
十分受益，感激感激．斑竹，请问要不要考虑细胞体积这个问题，不同的细胞体积是不同的，是否需要特殊考虑？
yizhi (2015-8-12 16:52:38)
如果是一个功能正常的细胞和亚健康状态细胞（但不凋亡或坏死）MTT 检测的OD值会有不同吗？
standup (2015-8-12 16:53:15)
请问：为什么用96孔，而不可以用24孔板呢？
S6044 (2015-8-12 16:56:00)
酶标仪就是与96孔板或专用酶标板配合使用阿，好像没有24孔的酶标仪，所以要限制培养板
dior (2015-8-12 16:56:15)
麻烦问一下，你们的1640是加酚红的还是不加的？
如果是加酚红的那1640的颜色会不会影响最后的OD 值啊，
谢大家了！
dior (2015-8-12 16:58:47)
我做了好久没做出来，我的细胞浓度蛮高的，10（7）左右，我做的淋巴细胞的增殖，
在显微镜下看加了CONA的孔细胞明显成簇，但测的结果反而小，
还有我在显微镜下看好像细胞不是完全反映，加了MTT后结晶溶解也不好，有没有那位师兄师姐作过这方面的详细的给我说说怎么做，不胜感激！！
caihong (2015-8-12 16:59:10)
波长490？？？不是 570？？
ldh (2015-8-12 16:59:27)
我来说说自己的经验吧！
1、我用的是无酚红的1640培养基，根据高人的指点和有关资料得来。
2、细胞浓度过大会影响测试的结果，主要原因是紫色结晶过多，不易在短时间内溶解完全。
3、看了很多资料，一般建议的波长为570，但是为了更准确一些，一般采用570-630双波长，如果板子是重复使用的话，最好使用双波长测定，因为本底的差异较大。
qhyu (2015-8-12 16:59:54)
QUOTE:
使用有酚红的培养基，有不加药的细胞对照不可以么？另外，请问使用双波长，发现结果是570的和630的趋势根本不一样，那么应该怎么计算？qhyu (2015-8-12 17:00:55)
1、我用的是无酚红的1640培养基，根据高人的指点和有关资料得来。
3、看了很多资料，一般建议的波长为570，但是为了更准确一些，一般采用570-630双波长，如果板子是重复使用的话，最好使用双波长测定，因为本底的差异较大。
请问wjcib：
即使使用有酚红的培养基，有不加药的细胞对照不可以么？另外，请问使用双波长，发现结果是570的和630的趋势根本不一样，那么应该怎么计算？
abc816 (2015-8-12 17:01:26)
kulee (2015-8-12 17:01:48)
请问，吸去培养基，加DMSO之间需不需要用PBS洗以充分减小培养基的影响？在这个过程中需要离心吗？
因为我做的次数不多，发现如果不离心有时会出现蓝色颗粒易吸出的现象。
谢谢！
mimili_901 (2015-8-12 17:02:37)
请问：为什么加MTT或者DMSO之前要把上清弃去呢？不弃，直接加会影响结果吗？
谢谢！
shkudo (2015-8-12 17:02:57)
想请问一下，在加入MTT前我吸掉培养基再加是否会影响结果？
xyw5 (2015-8-12 17:03:20)
lz, 请教一个问题。我是做OGD模型中某种药物对细胞损伤的保护作用。此时，我想算出药物的ec50该如何计算呢？直接算的话似乎不行吧，OGD完了以后细胞就死了一半了。
小明 (2015-8-12 17:03:39)
MTT做药物最佳溶度如何做
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