【求助】菌落PCR分析

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• 园丁## (2015-8-31 18:10:02)

  QUOTE:

  原帖由 bongte 于 2015-8-31 18:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  各位老师好,我直接从选择培养基上用接种环挑选阳性克隆菌落置到我配好的PCR反应体系中进行PCR的做法是不是错误的?我尝试过不裂解直接加入,电泳后条带都是空的,想问的是,菌落PCR之前是否一定需要碱裂解粗提质粒DNA? ...

  不用吧，我以前都是直接挑去做的。都很好。可能有些比较“顽固”就要裂解吧。

• luoliqiong (2015-8-31 18:10:22)

  
  我一般不是加入裂解液的，直接加到pcr体系中（无酶），100度10分钟，然后加入酶开始pcr。
  因为上面经常出现假阳性，所以我一般用测序引物，比如m13引物进行pcr，如果用自己的特异引物，最好是摇菌后，收集2微升，离心取沉淀，用pcr体系（无酶）溶解，100度10分，加入酶，pcr.
  我用的效果还不错

• bongte (2015-8-31 18:10:38)

  你是用相应的培养基扩大培养摇菌后,取2微升菌液,然后离心取沉淀,直接加入PCR反应体系中进行反应的吗?

• bongte (2015-8-31 18:11:51)

  你能讲讲具体过程吗?从挑了阳性克隆的菌落后,怎么处理后再加入PCR反应体系呢,直接将挑菌的接种环放进PCR反应体系混合液中涮一下而已吗?先谢过啦

• panda王 (2015-8-31 18:12:10)

  
  1.  挑取单菌落的方法;
  50 ul（引物）  灭菌去离子水  34ul
    引物1()  1 ul
    引物2()  1 ul
    10×buffer  5 ul
    MgCl2  1.5 ul
    dNTP  1ul
    模板( hl-60的CDNA)  5 ul
    Taq酶（用前甩一下，且不要吸取底部物质）  0.2 ul
  3min 30sec 50sec 1min 10min
  94℃预变性 94℃变性 55℃退火 72℃延伸 72℃延伸
  30次
  将除酶以外的体系加完，同时准备5个装有1ml的LB培养基的大EP管，用消毒小枪头将单菌落挑入到体系中，煮沸10分钟（如果菌落太多会出现很多非特异性的条带）冷却10分钟后，再加入酶混合
  2．菌液;一般取1ul过夜菌液，但是OD值以及用量没有规定，且无需加热
  3．在作菌落PCR的时候，出现菌落的PCR呈阳性结果但是摇菌却得不到东西，所以决定先摇菌，但是如果菌液PCR也不可靠，要提取质粒DNA后再作PCR

• wawa (2015-8-31 18:12:29)

  
  我们的做法是将菌落挑到10ul 0.02M的NaOH中，取2ul作为20ul体系的模板。

• dog002 (2015-8-31 18:13:05)

  
  可以在PCR test阳性的基础上再做个Test expression呀

• summerxx (2015-8-31 18:13:23)

  恩，需要高温裂解一下

• free (2015-8-31 18:13:47)

  
  请问
  我直接挑单克隆摇菌，再以菌液作为模板pcr，结果阳性率很低，有一次，5个有一个阳性，一次10个中一个阳性，师姐师兄们说他们的阳性率都很高， 我想除了TA连接，转化的原因外，会不会与我没高温裂解有关？
  多谢

• finger (2015-8-31 18:14:08)

  请问
  我直接挑单克隆摇菌，再以菌液作为模板pcr，结果阳性率很低，有一次，5个有一个阳性，一次10个中一个阳性，师姐师兄们说他们的阳性率都很高， 我想除了TA连接，转化的原因外，会不会与我没高温裂解有关？
  多谢
  ......
  
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  1. 一般过夜菌液不要超过1μl （25μl体系），太多不容易裂解。
  2. 94℃或95℃预变性的时候，菌液已经裂解了。我一般预变性4-5min.