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字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2016-4-06 15:31 作者: HP007 来源: 分析测试百科网
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原帖由 idea2011 于 2016-4-6 16:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '') 求助: 我的两个片段是750BP左右,它们相差十几个BP,我想分开这两个片段,并且想回收.请问我该用多大浓度的胶? 怎么回收?用银染可以回收吗?和用EB回收方法一样吗? ...
原帖由 许愿精灵 于 2016-4-6 16:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '') 俺的也是750左右,相差十几个bp。目前也还没分开。
原帖由 hdmi 于 2016-4-6 16:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '') 要用梯度胶分离两个相近片段。
最新回复
33号 (2016-4-06 15:32:32)
应该可以分离的,因为聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用来检测点突变和基因微卫星,都是对小片段异常的检测,分离10bp片段应该是可以的,但要注意选择合适的胶浓度和交联度,可以参考分子克隆书
45778 (2016-4-06 15:32:50)
个人认为,用普通聚丙烯酰胺凝胶电泳是分辨不出的,
1.双链DNA分子存在构象上的差异,其直链,环与超螺旋的迁移率有一定差别,在带型判定上会引起混淆
2.普通聚丙烯酰胺凝胶电泳的有效分辨率只有在凝胶浓度达到20%时,分辨率才能达到10bp,但此时的分辨范围只有10bp-100bp,恐怕不能达到实验要求。
建议使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,即加入8M尿素的聚丙烯酰胺凝胶,尿素可使DNA双链打开全部呈单链状态,消除了构象带来的干扰,分辨率最高可达1bp。
831226 (2016-4-06 15:33:06)
HPLC使者 (2016-4-06 16:05:26)
我做过相差这么大的片段,用非变性聚丙烯酰胺凝胶肯定没问题,具体用多大浓度,就看你的片段长度了,DNA片段长度与丙烯酰胺的浓度选择如下:
DNA片段长度(核苷酸数) 丙烯酰胺(%)
1Kbp~700bp 3.5
700bp~500bp 5
500bp~200bp 8
200bp 12
viviwang1987 (2016-4-06 16:11:48)
我做了一个月了可以用非变性聚丙烯酰胺凝胶分开10bp的DNA片断。用的是12%浓度胶。电泳仪和电泳槽是美国amersham公司。marker是大连宝生物公司20bp梯度marker,范围是20-200bp。你的电泳片断在200bp以下应该可以分出。
电压是50v,时间是3h。胶为9cm长,20bp,40bp,60bp间隔约1.5cm。
u76mp (2016-4-06 16:13:13)
我最近也要做PAGE,我的目的片段在50-150bp,我也觉得选择非变性PAGE,浓度大约在8%-12%比较合适,但是我还有一个疑问:在分子克隆书 书上提及的关于染料溴酚蓝的迁移率是什么意思啊,对电泳分析结果有什么影响吗?谢谢指教
8princess8 (2016-4-06 16:13:31)
另外一点就是电泳时间最好久一点,2~3小时,根据玻璃板的长度和电压而定。所以玻璃板最好要长点,30~40cm为佳。但象你只分开10bp片段,无需这么长,20cm左右就可以了。
idea2011 (2016-4-06 16:13:47)
我觉得可以用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,我们法医物证教研室就用的浓度为6%交联度为4%的PAG,电泳槽是自制的,通过银染的方法进行STR基因分型,重复单位是4bp,效果很好啊。
关键是实验室的设备条件的差异,需要选择最合适的电泳条件。我们用的是恒流,当然也可以恒压电泳。
idea2011 (2016-4-06 16:14:12)
求助: 我的两个片段是750BP左右,它们相差十几个BP,我想分开这两个片段,并且想回收.请问我该用多大浓度的胶? 怎么回收?用银染可以回收吗?和用EB回收方法一样吗?
许愿精灵 (2016-4-06 16:16:16)
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俺的也是750左右,相差十几个bp。目前也还没分开。hdmi (2016-4-06 16:22:08)
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要用梯度胶分离两个相近片段。831226 (2016-4-06 16:22:52)
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我最近也要做PAGE,我的目的片段在50-150bp,我也觉得选择非变性PAGE,浓度大约在8%-12%比较合适,但是我还有一个疑问:在分子克隆书 书上提及的关于染料溴酚蓝的迁移率是什么意思啊,对电泳分析结果有什么影响吗?谢谢指教溴酚蓝的迁移率是指溴酚蓝在电泳时相当于多少bp的片段,比如在12%聚丙烯酰胺胶里相当于20bp的片段额。。。。应该是这样的
【求助】聚丙烯酰胺凝胶电泳