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酶蛋白含量测定及比活性分析
关键词：一级标准物质 农药多残留分析 环境监测标准物质 烟煤标准物质酶蛋白含量测定及比活性分析
测定各上清液中蛋白质含量和酶活性水平，计算各分离步骤的比活性等指标，可以分析和评价分离纯化的效率，掌握酶分离纯化的基本知识。
酶的活性可用酶促反应进行的速度来表示，反应速度越大酶活性越强。酶促反应速度可以采用单位时间内底物的消耗量或产物的生成量来表示。
随着酶的不断纯化，其比活性也逐步增加，可以用比活性来鉴定酶制剂的纯度、评价纯化效果。
(一)考马斯亮蓝G-250(CBBG-250)法测定各上清液中蛋白质含量
【实验原理】
CBBG-250是双色型蛋白质染料，其游离型呈红棕色，最大吸收峰为465nm。在酸性环境下可与蛋白质结合，结合型CBBG-250呈蓝色，最大吸收峰移至595nm。在一定条件下，595nm处的吸光度增加与蛋白质含量成正比。染料与蛋白质能迅速结合，2分钟内达到平衡，1小时内保持稳定状态。
【试剂与器材】
1．CBBG-250溶液 称取考马斯亮蓝G-250 100mg，溶于50ml 95％乙醇中，加入85％磷酸l00ml，用蒸馏水定容至lL。
2．1mg/ml蛋白质标准溶液。
【操作步骤】
1．蛋白质标准曲线的制作除空白管外各管均作平行管。
蛋白质标准曲线的制作
加入物(m1) 空白管 1×2 2×2 3×2 4×2 5×2
蛋白质标准液 一 0．02 0．04 0．06 0．08 0．10 。。
蒸馏水 0．10 0．08 0．06 0．04 0．02 一
CBBG一250溶液 5．0 5．0 5．0 5．0 5．0 5．0
蛋白质浓度(mg／m1) 0 0．02 0．04 0．06 0．08 0．10
混匀后，室温放置2分钟后，在1小时内595nm波长下测定各管吸光度，以空白管调零。然后以各管吸光度值的平均值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标绘制蛋白质标准曲线。
2．各上清液中蛋白质含量的测定 除空白管外各管均作平行管。
混匀后，室温放置2分钟后，在1小时内595nm波长下测定各管吸光度，以空白管调零。根据各管吸光度值的平均值在校正曲线上查取各管的蛋白质浓度。
【注意事项】
1．各上清液的蛋白质含量不同，需要根据具体情况将上清液稀释后再测定，结果乘以稀释倍数即可。
2．本实验中所测得的蛋白质为总蛋白，包括ACP在内的上清液中所有的蛋白质。
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