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字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2015-8-31 18:15 作者: memory 来源: 分析测试百科网
QUOTE:
原帖由 H2O 于 2015-8-31 18:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '') 千万不要用肝素抗凝,那样PCR做不出来的
最新回复
H2O (2015-8-31 18:15:36)
可以库存的。最好在-80度。
一般不需要特殊步骤,冻溶之后按照正常提取DNA的步骤来做就可以了
我是做PCR的,应该没问题
H2O (2015-8-31 18:15:54)
千万不要用肝素抗凝,那样PCR做不出来的
remonte (2015-8-31 18:16:12)
谢谢!那么我们没有-80度冰箱,只有-20度的怎么办?
memory (2015-8-31 18:16:58)
谢谢!那么我们没有-80度冰箱,只有-20度的怎么办?
阿k (2015-8-31 18:17:15)
我们这儿的科室做HLA分型时,正是用EDTA抗凝的全血提取DNA。我们一般先将标本分装成2~4个EP管,冻存于零下20度冰箱中,存放时间很长,半年没问题,只要不是反复冻溶全血标本就可以了。
gmjghh (2015-8-31 18:17:32)
DNA非常稳定的,特别是只需要它做PCR的时候,因为这时对DNA的完整性要求不高(有人为了提高PCR效率,特别将基因组DNA打断或酶切一下)
DNA酶在-20℃没有活性的,放心好了。
我曾经有几管EDTA抗凝血,在4°C放了一个多月,PCR非常好。
gmjghh (2015-8-31 18:17:52)
QUOTE:
我觉得不一定,我们用的抗凝剂都是肝素,但PCR效果也不错的。veiwu (2015-8-31 18:18:08)
可以库存. 如短期内提取,可以存放在-20冰箱。但如果近期不提,最好存放在
-80度冰箱,保险些。
H2O (2015-8-31 18:18:27)
我用肝素抗凝的做过,平均只有20%出结果,其余都没有结果!
用EDTA抗凝的,全有结果
dhpbj (2015-8-31 18:18:43)
各位大侠,能否传个Protocal上来呀?我们老师非让用自己配的试剂提取,不让用试剂盒,用不用提取前对血进行WBC的分离处理?小妹在等!!
yes4 (2015-8-31 18:19:02)
Protocal
1. 分离外周血白细胞
(1)取患者肘静脉血5ml,EDTA抗凝,2500rpm离心10 min。
(2)小心吸取上层血浆,分装到3个0.5ml离心管中。
(3)在血细胞中加入3倍体积的溶血液,摇匀,冰浴15 min。
(4)2500rpm离心10 min,弃上清。
(5)加入10ml溶血液,摇匀,冰浴15 min。
Devil3000rpm离心10 min,弃上清。
(7)倒置离心管,去掉残液。
Musical Note得白细胞,-80ºC冻存。
2. 从白细胞中提取基因组DNA
(1)取白细胞,加4.5ml SE,使劲吹打,混匀。
(2)沿管壁加入0.5ml的10%SDS。
(3)加蛋白酶E 50μl/管。
(4)首尾轻摇10 min,混匀。
(5)37ºC水浴过夜。
Devil第二天取出,沿管壁加3 ml饱和NaCL,迅速手摇15秒,使蛋白变性析出。
(7)4000rpm离心10 min。
Musical Note取出上清,放于另一管中,加入等体积的三氯甲烷,混匀15 min。
(9)2500rpm离心10 min。
(10)取出上清,加入等体积的三氯甲烷,混匀10 min。
(11)2500rpm离心10 min。
(12)取上清,转入50ml管中,加3倍体积无水乙醇。
(13)首尾轻摇,见DNA絮状沉淀析出。
(14)将DNA挑至管壁,75%乙醇洗涤2遍。
(15)将DNA挑至0.5ml管中,冻干。
(16)加TE 300μl,使DNA溶解,4ºC保存。
yes4 (2015-8-31 18:19:24)
1. DNA提取用试剂
灭菌双蒸水(ddH2O)
0.1M HCL: 10M HCL1ml加99mlddH2O。
0.1M Tris: 1.21gTris加ddH2O溶解定容至100ml。
0.1M Tris- HCL(pH8.0): 0.1M HCL58.4ml加0.11M Tris碱100ml。
0.5M EDTA(pH8.0): 称取186.1g Na2EDTA.2H2O, 用700mlddH2O溶解,用10M NaOH调校至pH8.0(50 ml)。
低渗溶血液: 氯化铵7.01g,碳酸氢钾0.07g,加ddH2O定容至1000ml。
SE: 醋酸钠1.36g,氯化钠4.38g, 用400mlddH2O溶解, 冰醋酸调pH至5.6, 定容至500ml。
蛋白酶E: 10 mg/ml
TE: 1M Tris- HCL(pH8.0)1ml, 0.5M EDTA(pH8.0)0.02 ml, 加ddH2O至100ml。
yes4 (2015-8-31 18:19:43)
上面方法简单、省钱
seagate (2015-8-31 18:19:56)
我看很多书上说用ACD抗凝更好,不知道是不是这样呢?
seagate (2015-8-31 18:20:22)
kewanqi2011 (2015-8-31 18:20:40)
当然不是用干粉,配成0.5MOL/L的浓度,一般我抽5ml血,加65ul的EDTA,但要混匀,个别还是有凝血,但EDTA又不能加的太多,否则影响DNA的提取
iii_ii (2015-8-31 18:21:05)
EDTA抗凝用2.5%的溶液,与血液之间体积比一般是1:10
wawa (2015-8-31 18:21:22)
如果用陈血用试剂盒提取DNA,第一步请一定用三蒸水裂解红细胞两到三次,新鲜血不用,后面的就可以按照步骤做,这样效果会好一点。
hustwb (2015-8-31 18:21:43)
1 DNA提取
⑴ 新鲜外周静脉血3~5ml,以ACD(柠檬酸纳缓冲液)1/7体积抗凝;
⑵ 3500rpm 15分钟离心,吸除上层血浆;
⑶ 加5倍体积蒸馏水(灭菌),摇匀,静置5~10分钟,3500rpm15分钟离心,去上清,(若沉淀不够,可重复1~2次);
⑷ 吸取沉淀(少许液体)放入1.5ml离心管,STE 清洗2次;12000rpm 7~8分钟离心;
⑸ 去上清后加0.5mlSTE,10%SDS 25~30ml,蛋白酶-K 5μl(100μg/ml)37℃消化过夜,直至沉淀物溶解为止;
⑹ 等体积饱和酚,倒转摇匀10分钟。12000rpm 5分钟,离心,吸上层入另一1.5ml离心管;勿吸入蛋白层;
⑺ 上清液加等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:10),倒转混匀10分钟。12000rpm 5分钟,离心,吸上层入另一1.5ml离心管;
⑻ 上清液加等体积氯仿:异戊醇(24:1),倒转混匀10分钟,12000rpm5分钟,取上清入另一管;
⑼ 加1/12体积3M 醋酸钠,混匀后再加3倍体积的4℃无水乙醇,轻柔振摇;应出现白色絮状物(DNA);于-20℃放置20~30分钟,12000rpm 低温(4℃)离心10分钟,沉淀DNA,去上清;
⑽ 加1ml 70%乙醇洗涤,12000rpm 低温(4℃)离心10分钟,去上清,重复1次;
⑾ 自然干燥后,用pH8.0TE溶解,保存在-20℃备用。
2 DNA浓度的测定取15ul DNA 标本加1485μl 双蒸水,充分混匀后,用紫外分光光度计测定波长分别为260nm、280nm、330nm时的OD值,计为OD260、OD280、OD330,计算浓度和比值,判断DNA的浓度和纯度。
DNA浓度(μg/ml)=(OD260-OD330)×50μg/ml×稀释倍数(100)
DNA纯度=(OD260-OD330)/(OD280-OD330)
若DAN纯度<1.6, 表明有残存酚或蛋白含量太高,用氯仿抽提纯化。
3 DNA的纯化
⑴ 加等体积氯仿;异戊醇,轻轻振摇5分钟,12000rpm低温离心5分钟,吸取上层水相至另一EP管;重复一次;
⑵ 加入1/12体积的3M NaAC,混匀,再加入2.5倍体积无水乙醇沉淀DNA;12000rpm低温离心5分钟,去除上清;
⑶ 加1ml 70%乙醇洗涤,12000rpm 低温离心10分钟,去上清;重复1次;
⑷ 真空干燥,加适量TE溶解,置4℃备用。
baidukk (2015-8-31 18:22:00)
EDTA抗凝可直接买EDTA抗凝真空抽血管,好处是方便,并且抽血体积固定,并且EDTA抗凝液在管臂混合均匀。
【求助】抗凝血DNA的提取