【求助】抗凝血DNA的提取

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【求助】抗凝血DNA的提取

本人要做抗凝血DNA的提取(EDTA抗凝),但是我想问一下可以库存后再做么?可以在-20度放多久?需要特殊处理么?有无实验步骤发来?谢谢!
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最新回复

  • H2O (2015-8-31 18:15:36)


    可以库存的。最好在-80度。
    一般不需要特殊步骤,冻溶之后按照正常提取DNA的步骤来做就可以了
    我是做PCR的,应该没问题
  • H2O (2015-8-31 18:15:54)


    千万不要用肝素抗凝,那样PCR做不出来的
  • remonte (2015-8-31 18:16:12)


    谢谢!那么我们没有-80度冰箱,只有-20度的怎么办?
  • memory (2015-8-31 18:16:58)


    谢谢!那么我们没有-80度冰箱,只有-20度的怎么办?
  • 阿k (2015-8-31 18:17:15)


    我们这儿的科室做HLA分型时,正是用EDTA抗凝的全血提取DNA。我们一般先将标本分装成2~4个EP管,冻存于零下20度冰箱中,存放时间很长,半年没问题,只要不是反复冻溶全血标本就可以了。
  • gmjghh (2015-8-31 18:17:32)


    DNA非常稳定的,特别是只需要它做PCR的时候,因为这时对DNA的完整性要求不高(有人为了提高PCR效率,特别将基因组DNA打断或酶切一下)
    DNA酶在-20℃没有活性的,放心好了。
    我曾经有几管EDTA抗凝血,在4°C放了一个多月,PCR非常好。
  • gmjghh (2015-8-31 18:17:52)

    QUOTE:

    原帖由 H2O 于 2015-8-31 18:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    千万不要用肝素抗凝,那样PCR做不出来的
    我觉得不一定,我们用的抗凝剂都是肝素,但PCR效果也不错的。
  • veiwu (2015-8-31 18:18:08)


    可以库存. 如短期内提取,可以存放在-20冰箱。但如果近期不提,最好存放在
    -80度冰箱,保险些。
  • H2O (2015-8-31 18:18:27)


    我用肝素抗凝的做过,平均只有20%出结果,其余都没有结果!
    用EDTA抗凝的,全有结果
  • dhpbj (2015-8-31 18:18:43)


    各位大侠,能否传个Protocal上来呀?我们老师非让用自己配的试剂提取,不让用试剂盒,用不用提取前对血进行WBC的分离处理?小妹在等!!
  • yes4 (2015-8-31 18:19:02)


    Protocal
    1. 分离外周血白细胞
    (1)取患者肘静脉血5ml,EDTA抗凝,2500rpm离心10 min。
    (2)小心吸取上层血浆,分装到3个0.5ml离心管中。
    (3)在血细胞中加入3倍体积的溶血液,摇匀,冰浴15 min。
    (4)2500rpm离心10 min,弃上清。
    (5)加入10ml溶血液,摇匀,冰浴15 min。
    Devil3000rpm离心10 min,弃上清。
    (7)倒置离心管,去掉残液。
    Musical Note得白细胞,-80ºC冻存。
    2. 从白细胞中提取基因组DNA  
    (1)取白细胞,加4.5ml SE,使劲吹打,混匀。
    (2)沿管壁加入0.5ml的10%SDS。
    (3)加蛋白酶E 50μl/管。
    (4)首尾轻摇10 min,混匀。
    (5)37ºC水浴过夜。
    Devil第二天取出,沿管壁加3 ml饱和NaCL,迅速手摇15秒,使蛋白变性析出。
    (7)4000rpm离心10 min。
    Musical Note取出上清,放于另一管中,加入等体积的三氯甲烷,混匀15 min。
    (9)2500rpm离心10 min。
    (10)取出上清,加入等体积的三氯甲烷,混匀10 min。
    (11)2500rpm离心10 min。
    (12)取上清,转入50ml管中,加3倍体积无水乙醇。
    (13)首尾轻摇,见DNA絮状沉淀析出。
    (14)将DNA挑至管壁,75%乙醇洗涤2遍。
    (15)将DNA挑至0.5ml管中,冻干。
    (16)加TE 300μl,使DNA溶解,4ºC保存。
  • yes4 (2015-8-31 18:19:24)


    1. DNA提取用试剂
    灭菌双蒸水(ddH2O)
    0.1M HCL: 10M HCL1ml加99mlddH2O。
    0.1M Tris: 1.21gTris加ddH2O溶解定容至100ml。
    0.1M Tris- HCL(pH8.0): 0.1M HCL58.4ml加0.11M Tris碱100ml。
    0.5M EDTA(pH8.0): 称取186.1g Na2EDTA.2H2O, 用700mlddH2O溶解,用10M NaOH调校至pH8.0(50 ml)。
    低渗溶血液: 氯化铵7.01g,碳酸氢钾0.07g,加ddH2O定容至1000ml。
    SE: 醋酸钠1.36g,氯化钠4.38g, 用400mlddH2O溶解, 冰醋酸调pH至5.6, 定容至500ml。
    蛋白酶E: 10 mg/ml
    TE: 1M Tris- HCL(pH8.0)1ml, 0.5M EDTA(pH8.0)0.02 ml, 加ddH2O至100ml。
  • yes4 (2015-8-31 18:19:43)


    上面方法简单、省钱
  • seagate (2015-8-31 18:19:56)


    我看很多书上说用ACD抗凝更好,不知道是不是这样呢?
  • seagate (2015-8-31 18:20:22)

    还有问个比较菜的问题,EDTA抗凝用的是干粉吗?和血液的体积之间需要什么比值关系吗?
  • kewanqi2011 (2015-8-31 18:20:40)

    还有问个比较菜的问题,EDTA抗凝用的是干粉吗?和血液的体积之间需要什么比值关系吗?
    当然不是用干粉,配成0.5MOL/L的浓度,一般我抽5ml血,加65ul的EDTA,但要混匀,个别还是有凝血,但EDTA又不能加的太多,否则影响DNA的提取
  • iii_ii (2015-8-31 18:21:05)


    EDTA抗凝用2.5%的溶液,与血液之间体积比一般是1:10
  • wawa (2015-8-31 18:21:22)


    如果用陈血用试剂盒提取DNA,第一步请一定用三蒸水裂解红细胞两到三次,新鲜血不用,后面的就可以按照步骤做,这样效果会好一点。
  • hustwb (2015-8-31 18:21:43)

    DNA的提取和纯化
    1 DNA提取
    ⑴ 新鲜外周静脉血3~5ml,以ACD(柠檬酸纳缓冲液)1/7体积抗凝;
    ⑵ 3500rpm 15分钟离心,吸除上层血浆;
    ⑶ 加5倍体积蒸馏水(灭菌),摇匀,静置5~10分钟,3500rpm15分钟离心,去上清,(若沉淀不够,可重复1~2次);
    ⑷ 吸取沉淀(少许液体)放入1.5ml离心管,STE 清洗2次;12000rpm 7~8分钟离心;
    ⑸ 去上清后加0.5mlSTE,10%SDS 25~30ml,蛋白酶-K 5μl(100μg/ml)37℃消化过夜,直至沉淀物溶解为止;
    ⑹ 等体积饱和酚,倒转摇匀10分钟。12000rpm 5分钟,离心,吸上层入另一1.5ml离心管;勿吸入蛋白层;
    ⑺ 上清液加等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:10),倒转混匀10分钟。12000rpm 5分钟,离心,吸上层入另一1.5ml离心管;
    ⑻ 上清液加等体积氯仿:异戊醇(24:1),倒转混匀10分钟,12000rpm5分钟,取上清入另一管;
    ⑼ 加1/12体积3M 醋酸钠,混匀后再加3倍体积的4℃无水乙醇,轻柔振摇;应出现白色絮状物(DNA);于-20℃放置20~30分钟,12000rpm 低温(4℃)离心10分钟,沉淀DNA,去上清;
    ⑽ 加1ml 70%乙醇洗涤,12000rpm 低温(4℃)离心10分钟,去上清,重复1次;
    ⑾ 自然干燥后,用pH8.0TE溶解,保存在-20℃备用。
    2 DNA浓度的测定取15ul DNA  标本加1485μl 双蒸水,充分混匀后,用紫外分光光度计测定波长分别为260nm、280nm、330nm时的OD值,计为OD260、OD280、OD330,计算浓度和比值,判断DNA的浓度和纯度。
    DNA浓度(μg/ml)=(OD260-OD330)×50μg/ml×稀释倍数(100)
    DNA纯度=(OD260-OD330)/(OD280-OD330)
    若DAN纯度<1.6, 表明有残存酚或蛋白含量太高,用氯仿抽提纯化。
    3 DNA的纯化
    ⑴ 加等体积氯仿;异戊醇,轻轻振摇5分钟,12000rpm低温离心5分钟,吸取上层水相至另一EP管;重复一次;
    ⑵ 加入1/12体积的3M NaAC,混匀,再加入2.5倍体积无水乙醇沉淀DNA;12000rpm低温离心5分钟,去除上清;
    ⑶ 加1ml 70%乙醇洗涤,12000rpm 低温离心10分钟,去上清;重复1次;
    ⑷ 真空干燥,加适量TE溶解,置4℃备用。
  • baidukk (2015-8-31 18:22:00)


    EDTA抗凝可直接买EDTA抗凝真空抽血管,好处是方便,并且抽血体积固定,并且EDTA抗凝液在管臂混合均匀。
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