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【求助】关于2-△△Ct法和双标准曲线法的适...
我先谈谈我的理解,欢迎指正!【求助】关于2-△△Ct法和双标准曲线法的适...
2-△△Ct法
适用于:目标基因的扩增效率和内参的扩增效率非常接近的时候
优点:只需做一个内参的标准曲线即可,节约试剂。
缺点:若目标基因扩增效率和内参扩增效率相差大时不适用。
双标准曲线法
适用范围:目标基因的扩增效率和内参的扩增效率有较大差异的时候
优点:简单,可以不用目标基因和内参的扩增效率相差多大。
缺点:比较费试剂,因目标基因也需做标准曲线。
我的问题:
1. 我实验需要做很多个不同的基因(小鼠),预实验发现目标基因和内参的扩增效率相差较大
按照我上面对这两种方法的理解,我应该使用双标准曲线法,但这样一来,试剂所费可是非常惊人的,因为我的基因很多。请问有什么好的建议,可否用2-△△Ct法?
2. 我想问对于内参的标准曲线我是不是每次pcr的时候都必需要做呢,可否做了一次后,下次直接调用前次的?
谢谢!
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最新回复
ero11 (2015-9-04 18:17:11)
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ending (2015-9-04 18:17:29)
估计您是刚开始设计定量,所以困惑可以从下面这篇文章得到:
Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2−ΔΔCT Method
Kenneth J. Livaka and Thomas D. Schmittgenb, 1
a Applied Biosystems, Foster City, California, 94404 b Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, Washington State University, Pullman, Washington, 99164-6534
Abstract
The two most commonly used methods to analyze data from real-time, quantitative PCR experiments are absolute quantification and relative quantification. Absolute quantification determines the input copy number, usually by relating the PCR signal to a standard curve. Relative quantification relates the PCR signal of the target transcript in a treatment group to that of another sample such as an untreated control. The 2−ΔΔCT method is a convenient way to analyze the relative changes in gene expression from real-time quantitative PCR experiments. The purpose of this report is to present the derivation, assumptions, and applications of the 2−ΔΔCT method. In addition, we present the derivation and applications of two variations of the 2−ΔΔCT method that may be useful in the analysis of real-time, quantitative PCR data.
Methods
Volume 25, Issue 4, December 2001, Pages 402-408
shkudo (2015-9-04 18:17:47)
xue258 (2015-9-04 18:18:13)
QUOTE:
今天读了这篇文章,针对我上面提出的问题,有下面的想法:我认为应该是可以用2−ΔΔCT ,前提是目的基因和内参在对照组和试验组的扩增效率相差不大(理论上讲应该没有差别!!!),但目的基因和内参相比,扩增效率大小不影响结果判断,因为是相对定量,可以反映一个相对的fold change。
对于要测很多基因的情况,我准备先比较一下对照组和实验组的内参以及随机做三个目的基因扩增效率,如果试验组和对照组相比无差异,则可以考虑同时测多个基因,而共用一组内参来控制上样量!
关于我的第二个问题,个人认为标准曲线只供参考作用,主要是控制模板拷贝数在一定范围内即可。第一次做了内参的标准曲线,而我们模板的样本拷贝数又在标准曲线的范围内,则后面的实验无需再做标准曲线。但为了控制上样量在每次qPCR过程中还是应该做参照。
欢迎讨论!
xue258 (2015-9-04 18:18:35)
QUOTE:
您说的这个方法有没有相关文献链接拜读一下?感觉很有意思。不过有个问题就是如果扩增时不加入参照基因,上样误差容易产生。该体系如何控制上样量的误差呢?
呵呵,关于省钱的问题,我觉得做任何实验都应该考虑,当然是在保证好的实验效果的前提下。
ququer787 (2015-9-04 18:18:51)
" 我认为应该是可以用2−ΔΔCT ,前提是目的基因和内参在对照组和试验组的扩增效率相差不大(理论上讲应该没有差别!!!)"
我个人的看法,其实真正符合用2−ΔΔCT法的并不多,因为要求目的基因和内参的扩增效率都接近100%,这其实并不容易实现。虽然可以找很好的公司设计引物,但要去优化整个实验体系-包括目的基因和内参的反应体系,从而找到使两者扩增效率为100%的反应程序并不是一件轻松的事情。所以相比起来,pfaff法更为方便,因为对于相同的基因,同样的反应体系,不同的处理组间的扩增效率是一样的(我的看法,欢迎指正) ,那么只需要找到在这一反应条件下目的基因和内参的扩增效率即可-也就是做两者的标准曲线,以后就用这个值来计算就可以了,感觉会更方便一些。
2541 (2015-9-04 18:19:08)
关于扩增效率对于相对定量(2−ΔΔCT )和绝对定量都是非常重要的,因为这里都牵涉到目的基因和人为引入的对照基因的扩增效率一致性的评估;
一般而言,为了避免扩增效率带来的bias,一般在引物设计、扩增条带大小(<250 bp)、扩增程序及Tm值方面都要尽可能的做到把扩增效率降低到最低(同一基因不同重复和不同基因之间的),因此,在此基础上,我们给出的fold changes是没有考虑到扩增效率偏差影响的。
祝福大家实验顺利!
ujne (2015-9-04 18:19:36)
2-△△Ct法
适用于:目标基因的扩增效率和内参的扩增效率非常接近的时候
优点:只需做一个内参的标准曲线即可,节约试剂。
缺点:若目标基因扩增效率和内参扩增效率相差大时不适用。
双标准曲线法
适用范围:目标基因的扩增效率和内参的扩增效率有较大差异的时候
优点:简单,可以不用目标基因和内参的扩增效率相差多大。
缺点:比较费试剂,因目标基因也需做标准曲线。
我的问题:
1. 我实验需要做很多个不同的基因(小鼠),预实验发现目标基因和内参的扩增效率相差较大
按照我上面对这两种方法的理解,我应该使用双标准曲线法,但这样一来,试剂所费可是非常惊人的,因为我的基因很多。请问有什么好的建议,可否用2-△△Ct法?
2. 我想问对于内参的标准曲线我是不是每次pcr的时候都必需要做呢,可否做了一次后,下次直接调用前次的?
谢谢!
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求助楼主,请问你是怎么做预实验知道 目标基因和内参的扩增效率的差异性的呢?我现在不知道怎么选择方法
yayya (2015-9-04 18:19:59)
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Takara有个详细的介绍产品选择和PCR原理等的PDF文档,下下来看看,很详细的。
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