综述:欧美国家拉曼技术在临床诊断领域的应用情况

2016-9-09 16:51 来源: 分析测试百科
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  分析测试百科网讯 拉曼光谱是一种分析分子结构的有用工具。拉曼光谱特征峰位置、强度和线宽可以提供分子振动、转动方面的信息,反映出不同的化学键或官能团。拉曼光谱作为一种无损、非接触的快速检测技术,已吸引广大科研人员的关注,并被应用于各行各业中。

  由于拉曼样品用量很少,不需要对生物样品进行固定、脱水、包埋、切片、染色、标记等繁琐的前处理程序,不仅操作简单,而且不会损伤样品,从而能够获得样品最真实的信息。另外,生物大分子多是处在水溶液环境中,研究它们在水溶液中的结构对于了解生物大分子的结构与性能的关系非常重要。水的拉曼散射很弱,干扰小,而且单细胞拉曼光谱能提供细胞内核酸、蛋白质、脂质含量等大量信息,可在不损伤细胞的条件下实时动态地监测细胞分子结构变化,可以对细胞、病毒等进行原位检测分析。

  由于拉曼光谱的诸多优点,近年来,越来越多的研究人员将拉曼光谱用于临床诊断研究中。

  拉曼光谱为很多医疗情况下的临床诊断开辟了新方法。“这是一种对人体生物化学、生理和病理微妙变化十分敏感的生物化学专业技术,” Vanderbilt大学生物医学工程教授、Vanderbilt生物光子学中心主任Anita Mahadevan Jansen说。“拉曼光谱可以区分微妙的东西,如荷尔蒙的变化等许多其他技术无法区分的东西。”因此,临床医生可以使用拉曼光谱进行更准确的差别诊断。但是拉曼所有的优势都伴随着挑战,其中最大的挑战就是信号弱。因此,用拉曼光谱捕获分子信息,需要非常灵敏的仪器。这项技术目前才真正开始揭示它到底能在多大程度上改变诊断科学。

  British Columbia 的BC癌症研究中心综合肿瘤部门成像单元杰出的科学家Haishan Zeng说:“拉曼光谱是一种强大的分析测量手段,在化学实验室已经使用多年。尽管如此,医疗应用所需的数据采集时间太长。在过去的十年中,激光技术、CCD相机和光学的发展缩短了采集拉曼光谱的时间。这使得它有足够快的速度可以用于医学。推动拉曼临床应用的时候到了。”

  到目前为止,仅有几家公司在临床应用市场上有拉曼设备。如,Richmond,Verisante Technology为癌症检测提供拉曼设备。在日本东京,嘉丽宝化妆品公司用拉曼光谱来研究人体皮肤的变化。

  谈到这一技术在医疗诊断中的地位,Mahadevan Jansen说,“大多数是一些小型初创公司在尝试渗透市场。只有少数人在做临床拉曼光谱,因为挑战性太大。”尽管如此,她指出,现有的技术和计算能力使这种技术成为一种有价值的新诊断工具。

癌症诊断与检测

  癌症是威胁人类健康和生命的最大疾病之一。目前的医学发展水平尚不能对癌症进行彻底治疗,如果能够在早期发现和诊断,绝大多数癌症都是可以治疗的。因此,癌症的尽早发现在临床医学上具有重要意义。目前,拉曼光谱已经被用于多种组织癌如皮肤癌、乳腺癌等的检测与诊断研究中,并取得了重要的研究成果。

  皮肤癌

  皮肤是人体的最大器官,人类最普遍的癌症就是皮肤癌,并且其发病率正在急剧上升。

  美国哈佛大学的科学家在最新研究中利用受激拉曼散射(SRS)显微镜技术,在无需荧光标记的情况下,观察到活体皮肤癌细胞分裂过程中DNA分子动力活动机理。新技术是一种不用着色的非标记技术,可在不干扰细胞正常进程的条件下了解细胞癌变程度。

  研究人员对使用苯二甲酸(TPA,可促进细胞分裂)的老鼠皮肤进行了活体研究。除了同样观察到上述细胞周期的每个阶段,他们还观察到癌细胞中染色体的迁移,发现细胞有丝分裂活动高达18个小时,24小时后下降。这是首次细胞有丝分裂率在活体内以量化方式记录。

  他们还检测了该技术在诊断人类肿瘤中的可行性。实验采用三位鳞状细胞癌患者的皮肤癌组织作为样本。他们发现,癌变细胞的有丝分裂在不断增加,从而增加细胞分裂和细胞增殖。这表明新方法可与传统染色病理诊断相提并论。此外,新技术还能让研究人员对肿瘤细胞有丝分裂动力学进行量化研究。研究人员表示,该技术可用来计算体内有丝分裂速度,有助于皮肤癌诊断。

  研究人员表示,该技术提供了自然环境下细胞和细胞核的高分辨率影像,对于无创皮肤癌诊断和癌细胞快速评估具有较好的应用前景。

  British Columbia BC癌症研究中心综合肿瘤部门成像单元科学家Haishan Zeng从十多年前就开始了拉曼技术作为潜在诊断工具的研究。那时,一次扫描所花费的时间是20秒,这对于临床应用来说太慢了。有了先进的光学、激光、CCD技术和专有的拉曼探针设计,Zeng和他的团队将信噪比提高了16倍,并加快了分析过程,1.5秒就可以采集并分析一个拉曼光谱图。“这打开了拉曼光谱临床应用的大门。”Zeng说。

  2012年,Zeng和同事在癌症研究中报道,拉曼光谱可以区分癌变和良性的皮肤病变。现在,Zeng正与Verisante公司合作来进行商业化。“它帮助医生决定什么样的损伤需要活检,以及病变是癌变或良性的可能。”他说。Verisante公司在该研究中负责检测皮肤癌。研究结果显示,该设备可以检测95%的皮肤癌,能减少一到两倍不必要的活体组织检查。

  “目前,该设备唯一的商业应用就是检测皮肤癌,” Verisante资深科学家Michael A. Short说。Verisante的技术在加拿大、澳大利亚、欧洲已经被批准用于皮肤癌临床应用,该公司目前正在申请美国食品和药物管理局的批准。

  乳腺癌

  世界卫生组织(WHO)指出,无论是在发达国家还是发展中国家,乳腺癌都是女性的头号癌症。手术切除乳腺肿瘤的过程中,为了保证全部肿瘤组织被切除,大概的安全边缘样品会被切除拿去进行组织检查。此时,病人被缝合起来回家等待检测结果。如果该样本显示癌症,病人会回去进行更多的手术。除了等待的压力和第二次手术的痛苦,这也带来了第二次感染的机会。

  有了拉曼光谱,乳腺癌手术的结果可能会大大改善。Vanderbilt大学生物医学工程教授、Vanderbilt生物光子学中心主任Anita Mahadevan Jansen正在开发一个可以在手术室中扫描肿瘤并实时告诉医生是否所有肿瘤均被移除的工具。使用逐点扫描技术,Mahadevan Jansen和他的团队在8min内就已经扫描了直径几厘米的整个肿瘤。“当医生在做其他事情比如止血时,我们就可以扫描肿瘤,这是同步进行的。”他说。

  虽然Mahadevan Jansen的技术目前只被用来检查从病人身上移除的组织,他正在致力于能够从手术腔中采集数据的技术研究。他们还用它来观察腔中的淋巴结,以确定乳腺癌是否扩散。

  除了技术上的挑战,这一领域也面临着金融危机。就像所有的诊断医疗设备一样,基于拉曼技术的方法需要开发,然后通过临床试验批准,这通常需要一家公司许可的技术。虽然Mahadevan Jansen已经把一些技术申请了专利,但是并没有公司进一步开发它的商业用途。但是,他仍然保持乐观,尽管有公司将其他技术用于同样的应用。“我们比别人拥有更好的精确度和可靠性,但是仍需要研究和开发的市场转化。” Mahadevan-Jansen说。

  拉曼光谱在癌症中的应用会继续扩大,因为Mahadevan Jansen说它只需要研究和开发一个数据库和算法,就可用于其他实体肿瘤。

  在某一点上,这种方法可以超越癌症临床诊断来为手术做指导。也就是说,医生可以使用实时拉曼信号给出的信息,在手术过程中从本质上看到哪些是癌组织,哪些不是。

  拉曼激光也可以作为一种非侵入式的方法,替代典型的乳腺X光摄影检查术找出乳腺癌的迹象。这种激光可以“看透”身体组织并且生成不同的频谱,反映身体组织的不同情况。医生可以根据身体组织中蛋白质结构的性质改变以及蛋白质、脂肪和核酸相对数量的变化来确定肿瘤是良性还是恶性。

  英国卢瑟福·阿普尔顿实验室的研究人员一直使用拉曼激光分析乳房组织的钙化情况,钙化可能是癌症的初期迹象。英国格洛斯特皇家医院生物光子学研究部门的主管尼古拉斯·斯通表示,研究人员可以通过仔细查看这些钙化现象,来确定肿瘤是恶性还是良性。如果是恶性肿瘤,病人需要进行一次活组织检查,如果肿瘤是良性的,病人可免于检查。仅仅在英国,这种方法就可以让8万病人免于活组织检查手术。

无创血糖测量

  

       麻省理工学院(MIT)光谱实验室的研究人员宣布他们目前正在研究一台拉曼光谱仪,它可以测量血糖而无需血液样本。该仪器发射透过皮肤的红外线来测定组织间液的葡萄糖水平。发表在《分析化学》的论文中,研究人员描述了他们基于组织间质浓度测量血糖水平的算法。

  MIT光谱实验室的研究人员开发这项技术已经15年了。他们面临的一个主要障碍是近红外光只能穿透皮下0.5毫米的深度,所以它测量的是细胞间液的葡萄糖浓度,而不是血液中的葡萄糖浓度。为了克服这一点,该团队提出了一个涉及到这两个浓度的算法,使他们可以通过组织间液的葡萄糖浓度来预测血糖水平。

  然而,当病人进食含糖的食物后,校准就变得更加困难,因为血糖会立即迅速上升,而组织间液的葡萄糖水平需要5到10分钟才监测到相应的增长。因此,组织间液的测量并不能准确反映血流中的情况。为了解决延迟时间Barman和Kong开发了一个新的校准方法,叫作动态浓度校正(DCC),采用了葡萄糖从血液扩散到组织间液的速率。在对10名健康志愿者的研究中,研究人员使用DCC校准的拉曼光谱显著提高了血糖测量的准确性——平均提高了15%,有的甚至高达30%。

病毒/细菌快速识别

  病毒

  每隔几年,流感病毒的新变种就会出现并加入到流感季节循环常见的季节性菌株中。快速确定这些新的菌株,对于使用有针对性改善的流感疫苗来对抗流感是至关重要的。研究人员现在已经找到一种利用表面增强拉曼光谱(SERS)来识别新的流感病毒株的简易方法。

  在表面增强拉曼光谱(SERS)中纳米金颗粒在恰当的位置抓住一个流感病毒粒子

   研究人员发现新病毒的一种方法是采用免疫方法如ELISA(酶联免疫),这种方法要求有病毒抗体。另一种是聚合酶链反应,该方法需要了解病毒的DNA序列。为了识别DNA序列和蛋白质未知的病毒株Korea大学的Kwang-il Lim和Yeonho Choi以及他们的同事转而采用SERS的方法。在SERS方法中,关注的材料被耦合到金属表面(在该例子中,金属为纳米金颗粒),然后用激光激发。纳米金颗粒增强了分子发射的光谱信号。在新的研究中,研究人员用硫酸铜将纳米金颗粒聚集得更近,制造一个表面调谐来放大被束缚到纳米金粒子的病毒外壳蛋白质的发射光谱。

  用非感染性的病毒做研究来避免感染风险,该团队首次证明了流感病毒可以通过光谱和非流感病毒、水泡性口炎病毒区别开来。然后,该团队观察了不同的流感病毒株。

  流感病毒的两个表面蛋白血凝素和神经氨酸酶,通常用来确定亚型名称如:H1N1、H5N1,等等。通过分析从2009年出现的变种H1N1得到的数十个信号,研究人员确定了对应于H1N1和变异株的这两种蛋白质氨基酸序列的微小差异具体的峰。这些差异可以作为每一菌株表面H和N蛋白的信号,这表明菌株可以用表面增强拉曼光谱来区分。

  然后,他们把这两个H1N1病毒株的基因组结合在一起,制造出一种新的流感病毒株,该病毒株有一个独特的光谱结合峰可追溯到双亲本菌株。“我们的工作表明,将流感病毒的基因组重新搭配可以产生独特的拉曼信号,”Choi说,所以该方法具有无需免疫测定就可识别新出现的菌株的潜力。但是,到目前为止,该方法只用来在先前的特征病毒上进行测试,完全确定新菌株的拓展技术需要进一步的工作。

  在未来的工作中,研究人员的目标是通过改善基底表面来增强病毒蛋白的信号。据Choi介绍,通过附加实验,这种方法可以帮助确定其他流感病毒表面的蛋白如H5、N3等的拉曼峰的特征。

  细菌

  美国军队中战斗伤亡感染性并发症的比例约为35%。在战场上细菌试剂的早期诊断对受伤士兵的生存和照顾是至关重要的。适用于现场条件的诊断能力的进步有助于预防感染性并发症。

  美国圣安东尼奥海军医学研究院(NAMRU-SA)的科学家正在研究新技术和平台以快速和有效的进行传染性病原体的诊断。

  NAMRU-SA生物工程师和博士后研究员Christian N. Kotanen博士拿着一台电池供电的手持拉曼光谱仪,这台光谱仪可以在不到一分钟的时间内显示传染性病原体的生物分子“指纹”。

  表面增强拉曼散射光谱(SERS)技术,能生成如细菌和病毒等微生物唯一的生物分子“指纹”光谱。

  “研究人员最终希望看到一个具有完整功能的生物传感器系统的应用,这种系统对改善创伤有关的结果会产生影响。”

  NAMRU-SA的科学家最近展示的SERS设备能够识别与军队利益有关的5种细菌类型。通过NAMRU-SA设计的细胞溶解过滤过程,这些细菌从人类血清中以纯培养和细菌回收的方式得到。

  每种细菌的光谱表示固定频率下由细菌细胞壁的生物结构引起的单色光频率变化。亲水性的金黄色葡萄球菌和鲍曼不动杆菌很容易从血清样本中检测并确定,并且光谱不会因为样品处理而发生重大变化。对于疏水性的绿脓假单胞菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌主要是观察SERS光谱的相对峰强度的变化。使用这种技术,用于鉴定血液和组织样本中的一些细菌种类和菌株所需的作为参考标准的细菌SERS光谱库可以提前制定。

  SERS生物传感器还可以帮助护士进行适当抗生素治疗的管理。除了鉴定微生物感染之外,也可以通过观察被抗生素覆盖的纳米颗粒孵化后SERS峰强度的变化评估耐药性。

  NAMRU-SA的初步研究表明混合的革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌可以单独分离出来。为了增加细菌提取产量以及减少成分需求的样品制备分离的改进方法目前正在进行中。

无损血液质量检测

   研究表明,血液在储存过程中会发生变化,通常规定未使用的血液在6周后要丢弃。然而,血液的生化变化过程是复杂不清的,而且还有一些人捐赠的血液降解速度比别人快。

  卫生工作人员不会经常在输血之前检验血液,因为打开无菌储存袋取样很容易导致污染。

  从无菌储存袋中取出的血液可以用很多方法来进行分析,但是污染风险意味着卫生工作者不会经常在输血前检验血液。现在,Michael Blades 和 Robin Turner以及他们英属哥伦比亚大学的团队设计了一种能进行非侵入性分析的拉曼光谱方法,该方法可以保证捐献血液的完整性。

  “当前红细胞库的监管管理仅仅是根据每个人的年龄,没有考虑到捐献者中的自然变率,” 团队成员Chad Atkins 和 Kevin Buckley说。“我们感兴趣的是用光谱调查发生在红细胞之间的生化变化,而不是依赖于年龄的代替措施。”

  该团队使用的是空间偏移拉曼光谱(SORS)技术,该技术可以从激光照射点“偏移”处的位置采集光谱。偏移光谱光子扩散在样本内部深处比在表面的贡献大,所以SORS用于研究容器内的样品是十分理想的。该团队利用标准的光束控制光学拉曼显微镜将偏移引进到血液样品平台。这个简单的设置提供了袋内红细胞丰富的信息。

  英国国防科学技术实验室的光谱学专家Rebecca Hopkins说,“结果显示,在不影响样品的无菌性和质量的前提下,监测血液中的生化变化是有可能的。最终,这种非侵入性的分析方法可以防止患者受到医疗干预的有害影响。”

肾结石快速自动成分分析

  肾结石大小通常不会超过一粒米,但是也有一些可以生长到直径几厘米大小。有时,肾结石会阻塞输尿管,引起腹绞痛。如果不能溶解,肾结石是用体外冲击波疗法或微创内窥镜方法来处理的。

  许多患者遭受了疾病复发重复治疗的痛苦。科学研究表明,患者如果能够进行个体化跟踪护理和适当保护,新结石的形成率会降低50%。关于饮食习惯的建议或特定药物的使用策略是基于对结石组成了解的基础上给出的。在与工业伙伴合作以及弗莱堡大学医学中心Uro技术的分工中,Fraunhofer物理测量技术研究所(IPM)的研究人员正在开发一种新的基于拉曼光谱的肾结石快速、自动分析诊断系统,该系统可以显著改善结石治疗后患者的跟踪护理。这个项目的研究人员从事泌尿专业现代方法治疗肾结石病的工作。

  新的诊断系统使术后肾结石分析成为可能。在图片中,拉曼光谱系统正在自动分析肾结石。

  传统的肾结石分析技术如红外光谱是昂贵和耗时的,包括结石样品的制备也是如此。分析工作也只能在专门的实验室设施中进行,并且因为只有几个中心能提供这样的分析工作,可能需要三个星期才能收到分析结果。“病人在大多数情况下已经出院,就不会再看医生了。我们建议结石患者喝大量的水,增加身体活动,必要时减肥。但这只是一个一般性的建议。从临床的角度来看,我们需要个性化的方法,这些方法必须包括石头成分分析结果。这使我们能够评估个体疾病复发风险和检测潜在的代谢异常,” Fraunhofer IPM的医生兼研究人员,该工作的领导者Arkadiusz Miernik博士说。

  拉曼光谱使Miernik和他的团队能够迅速掌握结石特点,并最终确定具体的肾结石类型。该方法使用被分析样品在可见光波长范围内的化学指纹特征光谱,样品是用激光照射的。“约1%的光子被以不同的、与样品高度特异的波长反射回来。我们在数据库中记录这些信号。” Miernik说。然后,研究人员用计算机软件过滤出拉曼光谱使用计算机软件过程中产生的荧光背景。

  这种方法使用相对廉价的光学元件,它也可以分析潮湿、没有经过处理的样品。准备样品的时间大大减少。“之前在进行分析前必须把石头进行干燥和粉碎。我们的系统可以省掉这一步。在手术过程中收集的结石碎片,不需要进一步处理。可以直接放进拉曼光谱仪中进行分析。” Miernik说。目前,有几个专业实验室使用大型分析设备可以进行这一过程。适合在临床上使用的紧凑设备,允许立即、后介入的自动化分析技术尚未出现。

  研究人员已经开发出包括石头分析所需的硬件和软件的演示系统,并作为原型机生产出来。在进入市场之前,这台样机首先应该做的更紧凑。该系统的一个独特的特点是它的光谱数据库:建立了一个组成99%肾结石的9种纯物质的数据信息索引。研究人员在第一验证阶段中,对近160个肾结石样本进行了初步的研究。此外,在参比实验室进行传统的基于红外的分析之后,结果得到了确认。“一旦完整的系统投入临床使用,医生在手术后可以直接检查结石样品从而提高患者护理质量,” Miernik说。

骨骼/牙齿疾病的诊断

  美国密歇根大学化学家迈克尔·莫里斯过去几年一直使用拉曼光谱研究人体的骨骼。他表示,拉曼激光可以取代很多手术和诊断。拉曼光谱的一大好处是其非侵入,诊断速度比传统的手术方法更快,而且也更精确。他还解释说,当某人生病或即将生病时,其身体组织中的化学物质与健康肌体组织中的非常不同,因此拉曼光谱会在不同身体组织内发生变化。

  莫里斯说,这种诊断方法可以在几秒钟内完成,人们或许不再需要X射线。病人只需要将手腕放在桌子 上,戴上一种由硅制成的手镯状的物体,该物体同拉曼激光连接在一起。随后,研究人员让光纤传送拉曼激光,几分钟就可以收集到足够的信号,接着,将激光关闭,几秒钟就可以知道结果。

  莫里斯指出,除了骨科疾病,拉曼光谱也可用于探测蛀牙出现的早期征兆。另外,拉曼光谱技术诊断很多疾病时,病人不需要抽血。比如,为了探测胆固醇的含量,一个人只需对着激光即可。

皮肤含水量测定

  除了医疗诊断,拉曼光谱可以用来探索身体以及意想不到的用途。嘉丽宝化妆品之父花王公司的科学家,用拉曼技术来研究皮肤。嘉丽宝公司公共关系经理 Shinji Yamada指出,“我们从不使用该设备来诊断病情,我们用它来确定真皮的水分含量随年龄发生的变化。”

   事实上,嘉丽宝的科学家们利用拉曼光谱研究了皮肤的许多特征。例如,拉曼可以测量皮肤的粗糙度——随着年龄的增加,角质层变厚,从而使皮肤粗糙度增加。 但是这项技术不仅仅停留于表面。Yamada说:“我们可以用拉曼光谱测量从表面到内层的皮肤,比如,我们可以测量角质层的厚度以及从角质层到表皮到真皮上层的皮肤水分含量水平。”

  为了做出最好的化妆品,科学家需要对组织层以及它们随时间的变化做出最好的分析。

拉曼技术正在坐等临床转化

  “拉曼技术正在坐等临床转化。这项研究只需要有针对性地打破障碍,以拉曼作为临床工具向前迈进。” Mahadevan Jansen说。一旦这样,内外科医生将可以更加准确有效地诊断多种疾病。

  一项正在进行的研究表明,基于拉曼的设备可以广泛应用在临床诊断中。此外,该技术可以用于工业中用来检查特定组织的状态和健康,如皮肤,然后开发相应的商品。所有这些应用的基础包括使科学家和技术人员从分子振动的微弱拉曼信号中快速采集数据的所有技术的进步。十年前这似乎是不可能的,从现在开始的十年之后,拉曼光谱会常用在很多诊断工具中。