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基因检测在遗传性耳聋中的应用
1. 中国人群遗传性耳聋相关基因流行病学概况
最近的研究表明在中国相当一部分遗传性耳聋仅由为数不多的基因突变引起，以下就是我国遗传性耳聋患者所涉及的主要基因。
1.1 GJB2基因
GJB2基因突变导致的耳聋为语前、双侧、对称性耳聋，听力损失程度变异较大，可由轻度到极重度，但多数为重度或极重度耳聋，GJB2基因和先天性聋有着密切关系，中国先天性聋患者中携带有GJB2基因突变的约占20%。GJB2基因突变位点有很多，在亚洲人种中最常见的为235delC，在已完成的1680例非综合征性耳聋患者GJB2 235delc突变的筛查中发现，纯合突变148例，杂合突变157例，其中纯合突变检出率为8.81%。杂合突变检出率为9.35%，总检出率达18.16%。调查结果表明，GJB2 235delC缺失在中国耳聋入群中占有相当大的比例。
1.2 线粒体DNA（mtDNA）基因
线敉体基因突变（发生频率最高的为A1555G突变）与链霉素、庆大霉素、卡那霉素等氨基糖甙类药物引起的药物性耳聋有着密切关系。在已完成的2016例非综合征性耳聋线粒体DNA 12S rRNA A1555G突变筛查中，发现阳性病例57例，检出率为2.83%[13]。更为重要的是对其中有完整资料的52个家系的调查显示，每发现一个阳性患者，平均可以在其家系内发现发现3个耳聋患者，和10个携带A1555G突变的正常听力者，对于这一部分人禁用氨基糖甙类药物，可以有效避免药物性耳聋的发生。
1.3 PDS基因
PDS基因又名SLC26A4，在内淋巴管和内淋巴囊、Corti氏器外沟细胞、甲状腺中高表达，基因突变与弧立的大前庭水管综合征（LVAS）和Pendred氏综合征（前庭水管扩大或伴内耳畸形、神经性聋和甲状腺肿）有密切关系，临床上表现为先天性或后天性耳聋，耳聋发生或加重与外伤、感冒有关。对安阳市特教学校151例聋哑学生SLC26A4基因突变热点区域序列分析结果显示，31.79%患者检测到了SLC26A4基因的突变，包括双等位基因突变者26例（17.22%），单等位基因突变者22例（14.57%）。这3种基因引起的遗传性耳聋约占整个遗传性耳聋的80%。此外，GJB3的突变也能导致常染色体显性和隐性非综合征性耳聋，被认为与高频听力下降有关。该基因也是在我国本土上克隆的第一个遗传疾病基因，是我国克隆遗传性疾病基因零的突破。
耳聋基因检测为耳科领域出现的新技术、新方法，它具有几个重要的特征：（1）基因检测技术可以对一定比例的耳聋患者进行准确的分子病因分析，而以往非综合征性感音神经性耳聋诊断只能通过病史和排除法推测病因；（2）基因检测技术可以早于症状以及常规测听技术或影像技术发现耳聋易感人群；（3）基因检测可以作为部分病例常规测听或影像技术的辅助和补充检测技术，并实现远程检测；（4）基因检测配合筛查技术和产前诊断可以减少聋病发生、避免聋儿出生。
3.1 直接测序：
直接测序（direct sequencing，DS）是将聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增产物纯化、变性后，在测序仪上进行测序，为寻找突变的金标准。但其仪器设备昂贵，且操作复杂、耗时较长。此外，杂合突变、胶压缩、GC富集区的存在等问题使得很难通过一次测序获得精确的数据。
3.2 限制酶切指纹-单链构象多态性分析（restriction endonuclease fingerprinting-single strand conformation polymorphism，REF-SSCP）：
限制性核酸内切酶切割目标基因的PCR扩增产物，琼脂糖凝胶电泳检测梅切产物，根据异常构象带进行目标基因有无突变的判断。该方法最主要的问题是不能检测到所有的突变，由各实验室报道的突变检出率冲99%到35%不等。同时该方法要求多次摸索条件，如电泳温度，胶中甘油浓度以及胶联度等均可影响检测的灵敏度。此外，该方法也不能确定突变的精确位置。
3.3 限制性片段长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism，RFLP）：
是用特定的限制性内切酶水解目标基因的PCR扩增产物，然后分析酶解产物的电泳图谱特征，根据与正常对照的比对结果来判断待检样品是否存在某个基因突变，其弱点操作繁琐，检出率低，因为并非所有的基因突变都恰好位于某个内切酶的识别区[16]。
3.4 变性高效液相色谱分析（denaturing high performance liquid chromotography，DHPLC）：
此技术是一项在单链构象多态性分析和变性梯度凝胶电泳基础上发展起来的新的杂合双链突变检测技术。它能对大批量PCR扩增产物进行筛查，其在检测大量致病基因的不同序列方面显示出高度的敏感性，适合做快速的基因筛查。但它也有一些不尽如人意之处：（1）它只是提供了定性的信息，而无法得出具体的突变类型和突变位点。尚需测序等后续方法证实；（2）其结果判断通常是由操作者进行的，容易产生观察差异，不利于各实验室之间的灵敏度比较；（3）许多片段有多个主要解链温度，需要筛查的温度较多，增加的工作量。目前该技术主要用来检测200~300bp大小的DNA片段，长的DNA片段的检测尚未见报道。
生物芯片技术是生命科学研究中继基因克隆技术及其自动测序技术、PCR技术后的又一次革命性技术突破。
根据芯片上固定探针的不同，生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片等，如果固定的分子是寡核苷酸探针或DNA，称为DNA芯片或基因芯片。基因芯片在生物芯片中占有重要地位，它是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测，从而迅速得出所要的信息[16]。基因芯片技术因其具有微型化、集约化和标准化的特点，在感染性疾病、遗传性疾病、重症传染病和恶性肿瘤等疾病的临床诊断方面具有独特的优势，可将对应于突变热点趋的寡核苷酸探针合成点或点加于DNA芯片上，通过一次杂交完成对待测样品多种突变可能性的筛查，实现对疾病的高效快速诊断。
遗传性耳聋有很高的遗传异质性，与耳聋相关的基因至少有100个，这给临床检测带来了很大的困难，传统的基因突变检测手段费时费力，难以广泛的开展基因诊断，迫切的需要一种高通量、自动化的核酸序列差异检测带来新的曙光，它作为一种高通量、快速、简便的方法使得多基因、多位点同事检测成为可能。
Siemering等发表文章指出，应用等位基因特异性寡核苷酸芯片（ASO）对遗传性耳聋基因进行检测，检测结果准确可靠，但应用该方法完成整个检测需要2d时间；Gardner等和Cremers等相继报道了芯片微测序方法进行耳聋突变位点检测的进展，采用该方法完成检测需要6d，但由于需要四色荧光芯片扫描仪进行检测，如多重等位基因特异性PCR通用芯片技术（allele-specific PCR-based universal array，ASPUA），该芯片可在5h之内完成导致遗传性耳聋的4种常见基因（GJB2，GJB3，SLC26A4和线粒体12S rRNA基因）的检测。
大多数遗传性耳聋为感音神经性聋，除了人工耳（cochlear implant，CI）植入外，目前尚无有效治疗手段。人工耳蜗价格昂贵，在现阶段普及面窄，鉴于遗传性耳聋治疗困难的现状，因此，以生物芯片为代表的遗传性耳聋基因检测技术对于估算发病风险、减小耳聋发病率，具有非常重要的意义。一个已患有遗传性耳聋的人，可以得到准确诊断并作相应治疗；在患者血缘亲属中还没有达到发病年龄的人，可以通过检测是否带有该致病基因，预测将来是否会患病，甚至进行早期干预治疗。例如对于大前庭水管的患者。目前多是在发病后进行高分辨率颞骨CT检查后确诊，其预防意义已大为削弱，新生儿大规模的CT扫描在预防医学中难以实现，而快速简便的基因检测则有可能在婴儿出生后先于CT等影像学检查发现大部分此类患儿，从而采取严格的防护措施。通过基因检测可以做到早发现，这对于语前聋患者尤为重要，可以尽早利用残余听力佩戴助听器或植入电子耳蜗，防止患儿变哑，对于语后聋患者，可以部分预测以后发病的风险和发病的年龄阶段，从而尽早预防，并对患者的婚配、生育提供遗传信息。
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