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【求助】初学者双向电泳图像分析
【求助】初学者双向电泳图像分析
敬爱的前辈高手们：
我是个刚接触蛋白质组学不久的小菜鸟！前几天在师兄师姐们的指导帮助下跑了张双向电泳图谱（胶条17cm、PH4-7，二向胶浓度11%，G-250染色）。
图像右边看起来还凑合，可是左边横向成了“彗星”，maker 也不见了一条（不知道是不是因为没染上色，我扫描图像时没见到下边有蓝色横纹！），右边还有蓝色的 “竖带”也不知道是不是胶条PH没选好！。。。。。
总之，请各位前辈高手们帮我分析一下我的电泳图谱，也请大家提出改进建议和意见！谢谢各位高手前辈们了！
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最新回复
qqq111 (2013-10-07 15:40:11)
实验材料是石斛兰花芽，酚抽提法，上样量1mg左右
电泳条件如下： 50V 主动水化 12h
250V 线性 1h
1000V 快速 1h
4000V 线性 1h
10000V 线性 5h
10000V 快速 70000Vh
500V 快速 24h
二相使用的是GE的Ettan DALT six系统，上槽2*缓冲液，下槽1*缓冲液，电泳条件如下：
1W 30min
7W 7h
ssonglikihi (2013-10-07 15:40:33)
我觉得你电泳图的问题跟一向和二向电泳设置关系不大，如果说胶条的右边是7的话，那么右边蓝色的 “竖带”是因为蛋白的等电点超过了7而聚到了最右边，这部分蛋白需要换3-10nl或者3-10线性胶条分离，marker最下面一条跑没影了可能的原因很多，结合你的图上的状况我感觉你的胶可能还没有完全凝好就跑了，再个下次把二向胶浓度提到12.5%试试，而且电泳液记得新配
最大的问题是酸性端的整个模糊，主要原因是样品没有处理好有污染导致聚焦不良，我想知道你酚抽提法的具体步骤以及蛋白上样前是否再经过TCA/丙酮沉淀
yjf1026 (2013-10-07 15:41:11)
看了上面老师的讨论，学生想请教一个问题，我想做二维电泳的实验，但是因为起初不知道，标本取好以后没有用ＰＢＳ液冲洗，没有去除表面的血液，这样血液中高丰度的蛋白质会在胶上将会掩盖有意的蛋白质点。。。现在标本保存在液氮中，不知道怎样处理才能去除这些血液成分？？？？因为都已经冻在一起了。。。。十分焦急，谢谢帮助。。。
qqq111 (2013-10-07 15:41:32)
再次，再请教您几个问题：
请问我选用PH5-8的胶条可以吗？左边的蛋白没聚焦好，看起来也没什么分布！我灌好二向胶后隔夜放置了9.5h（23：30—9：00），且外用塑膜保水了！二向胶没聚合好是不是还有别的原因呢？再请您指教！电泳液也是隔夜配的，4度保存了大概10小时！12.5%的胶倒没用过呢，这个一定要试试！不过您能告诉我为什么这样做吗？我的技术很不专业、很不过关，还请您多多指点！
这是我的“酚抽提法”的过程：
称取春石斛芽，在预冷的研钵中液氮研磨成粉
↓
加750ul酚抽提液与1000ul水饱和酚混匀
↓
13200rpm 15℃ 离心25min
↓
吸取上层酚相，加入0.1M醋酸铵甲醇①
剩余下层水相，加入1000ulTris饱和酚混匀
↓
13200rpm 15℃ 离心25min
↓
吸取上层酚相，加入0.1M醋酸铵甲醇②
下层水相及杂质等丢弃
①和②-20℃沉淀过夜
↓
13200rpm 15℃ 离心30min
沉淀加入6-8ml的冷丙酮(0.07%β-ME)洗一次
(每次-20℃沉淀20min， 13200rpm 4℃ 离心30min，弃上清)
↓
沉淀加入6-8ml的80%冷丙酮(0.07%β-ME)洗一次
(每次-20℃沉淀20min， 13200rpm 4℃ 离心30min，弃上清
↓
沉淀加入1.5ml的冷丙酮(0.07%β-ME)洗两次
↓
真空干燥，蛋白沉淀-80℃保存
注：
酚抽提液（100ml，4℃保存）
蔗糖 0.7M 23.96g
氯化钾 0.1M 0.746g
EDTA 50mM 1.461g
Tris 0.5M 6.057g
HCl 30mM 0.25ml
双蒸水 定容到100ml
ß-巯基乙醇 2%（v/v）现用现加
蛋白上样前没有再经过TCA/丙酮沉淀！这个有什么关系吗？请您指点！
“最大的问题是酸性端的整个模糊，主要原因是样品没有处理好有污染导致聚焦不良”样品那里没处理好呢？这些污染主要是指什么呢？再次请您指点！谢谢您啦！
再次感谢！谢谢！
qqq111 (2013-10-07 15:41:52)
marker最下面一条（14.4KD）跑没影了可能不可能是我的胶浓度太低了呢？7h30min时间里它就自己溜达出去了！
再说，对于花芽这种核酸和鳞片较多的材料用什么方法提取蛋白会比较合适呢？
众位前辈高手们，大家帮帮忙吧！谢谢大家了！！鞠躬！！！
wmp1234 (2013-10-07 15:42:10)
你好,大致看了下你的提取过程,我初步怀疑是样品中的酚没有除干净,而且提取液中很多成分均可对聚焦产生污染和横温,第二向聚焦没有什么大问题,提高胶浓度是为了避免小分子量蛋白跑出胶,
不知道为什么要使用酚抽提,和蛋白的性质有关么.....如果条件允许的话试试GE的cleanup提取蛋白,可能效果会好些,祝你成功!
qqq111 (2013-10-07 15:43:09)
想再请教您几个问题：
1. 酚抽提蛋白后，酚没除干净？那样该如何改进以便除去酚呢？
2.“提取液中很多成分均可对聚焦产生污染和横温”很多成分是指哪些成分呢？该如何改进呢？
酚抽提法是一篇英文文献上看的，现在已经很普遍在用了!目前觉得与蛋白性质没多大关系，我们实验室摸索用了这种方法半年了，效果还可以！
以前也有师姐用过GE的cleanup提取蛋白，可是做完几乎没有蛋白了，大概GE的cleanup很不适用于我们的实验材料！
众位前辈们请给晚生一点指教吧！谢谢众位前辈了！
windy+++ (2013-10-07 15:45:15)
具体怎么除酚我不知道，因为没有用过这种方法，但我们常用的是ＴＣＡ／丙酮沉淀蛋白，然后用乙醚／乙醇 １；１把ＴＣＡ除掉，否则ＴＣＡ酸性带电荷会导致聚焦不良或短路，而且你提到样品中核酸和羚片比较多，可以适当提高Ｄnase酶的浓度，我们用的是promega的dnase，１ml加１５Ｕ单位，再蛋白上样前适当增加超速离心的步骤，除去不溶物和溶解度不好的蛋白，cleanup针对任何提取都可以，但会损失１／３的蛋白，所以你决定用cleanup需要加大最初的提取量
不知道你跑２Ｄ的目的是什么，如果想获得更好的图片效果我觉得你可以该用５－８的胶条
qqq111 (2013-10-07 15:45:34)
我也在考虑上加入适量的核酸酶，主要是考虑是加Dnase还是Rnase，花芽中含什么酶多一点？除去那种核酸最有必要呢？
我跑２Ｄ是很希望得到更多的蛋白，也想获得较为美观的图谱，后期还要质谱分析的啊！
我也是准备跑下PH5—8的大板看看呢！呵呵！
qqq111 (2013-10-07 15:45:57)
更正：。。。。。“花芽中含什么核酸多一点？”。。。。。。
831226 (2013-10-07 15:46:15)
去除残余酚可用300mM盐酸胍洗2次
plaa (2013-10-07 15:46:36)
RNA在室温下是很不稳定的,很容易降解的,主要集中力放在除去DNA污染上,我们超速离心的离心力是20000g离心一小时,这样跑出来的图没有纵条纹,很好看但是很多溶解度不是很高的蛋白在超速过程中被除去了,伯乐的说明书上植物蛋白是40000g离心半小时,可以借个超速的离心机试试,但要提高上样量
楼上的提到了除去酚的方法可以试一试,因为我觉得你的图主要是杂质污染引起的
qqq111 (2013-10-07 15:48:52)
原来除去酚是用300mM盐酸胍洗啊，我还真不知道，谢谢 lhl2225 前辈了！呵呵！
我也觉得RNA会比DNA影响小些，经bennyxiong 前辈指点后，那我用DNA酶就好了！
我最近新跑了张图！条件基本没变，18000rpm离心提取蛋白，胶浓度提高了，1W和5W恒功率电泳！只是这次上样量有点小了（大概不足800ul！）！不知道这张图的问题怎样？还请大家指教！谢谢！
89946559.snap.jpg
zzzz (2013-10-07 15:52:23)
已经好多了,你接着需要解决的问题是图象歪歪扭扭,估计胶凝得不是太好就跑了,再个某些纵拖尾,可能跟胶条和胶接触面接触的不是很好或者有气泡,也可能插入胶条的时候胶条面有损伤
qqq111 (2013-10-07 16:02:05)
呵呵！谢谢前辈的指教！
胶凝多长时间好呢？17cm的胶凝了4.5h。这次二向胶面看起来很平整，胶与玻璃板之间稍有气泡，胶条与胶面之间倒没看出有气泡。胶面损伤倒是在操作中有一点！Maker下边变得扭曲不知道是胶的原因还是其他什么原因？请指教！
呵呵！谢谢！我再继续改进,争取跑出好图!
is2011 (2013-10-07 16:06:41)
我们都是凝过夜或者更长时间,marker上样的时候没有上好
qqq111 (2013-10-07 16:07:13)
哦！这样啊！谢谢指教！
不过，前辈，什么叫marker上样的时候没有上好啊？应该怎么弄呢？我是将伯乐专用的那种小滤纸片放到含有10ulmaker的小离心管中浸润，二向时将浸好maker液的滤纸条放在胶条旁边的正极处的，滤纸条是平展的!按你说的，这该怎么操作呢？请指教！
831226 (2013-10-07 16:08:59)
不过，前辈，什么叫marker上样的时候没有上好啊？应该怎么弄呢？我是将伯乐专用的那种小滤纸片放到含有10ulmaker的小离心管中浸润，二向时将浸好maker液的滤纸条放在胶条旁边的正极处的，滤纸条是平展的!按你说的，这该怎么操作呢？请指教！
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差不多就是这样的，先把琼脂糖封胶液加进去，等凝得差不多的时候把浸润的滤纸片加进去，这样扩散的会比较少，注意不要加歪了，再个把胶条正极端多出来的塑料片剪掉，让marker紧靠胶条，一般太靠边了都跑不好
qqq111 (2013-10-07 16:09:37)
1.上图大板图胶中间和下部蛋白点较圆，左右聚焦都不好，左边横纹很明显是为什么呢？怎么改进解决呢？还有上图大板图胶上中间有蛋白点而两边没有，可能原因是什么呢?
2. 我跑了几次7cm小胶，分别用TCA/丙酮法，醋酸铵/甲醇法，酚抽提法提取石斛花芽蛋白，一向聚焦时大部分情况是电压升不上去，大概是3500-4000v之间，电流是50uA；聚焦结束后，胶条中间出现了大概0.3cm左右的白色肿胀区域，有时厚度甚至大于1mm。最近一次我用另一种酚抽提法提取蛋白后跑7cm小胶条，电压升到了4000v，电流为45uA，依旧有白色肿胀区域，我知道这是我的样品制备技术很不过关。很想知道这些白色区域到底是怎么造成的，我在样品制备时都该注意些什么呢？
还请大家提出具体的意见和建议！谢谢众位前辈们啦！
55647724.snap.jpg
831226 (2013-10-07 16:10:04)
这两张图均存在聚焦不良和杂质污染的问题，你所说的制样不过关和后面的电压升不上去是紧密联系在一起的，制样过程中为了沉淀蛋白而加入的试剂引入了新的离子干扰聚焦，白色区域肿胀是因为聚焦不良许多大分子的杂质（也可能是蛋白堵塞了凝胶），这些堵塞现象反映在图谱上就是一片区域蛋白分不开，一片区域空的
其实你发的所有图主要问题都是制样的时候杂质没除干净或者引入了新的离子（因为图谱中没有太高丰度的蛋白所以不存在高丰度蛋白影响聚焦的问题）
很多聚焦不良不是因为你操作的问题，而更多的是沉淀蛋白方法的局限性，或者说有些样品适合用这种方法提取有些样品因为自身的问题不适合用该方法提取，我们也遇到过这种现象，制样电压升压一点问题都没有，不同细菌跑出来的图有的很好有的就是没法看，最后改用cleanup纯化一下子就清晰了，晚上发张图让你参考下
酚抽提的我们没有做过所以没有发言权，汗，我只能解释这么多了
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