【求助】请教大家pcr电泳图

最新回复

• orangecake (2015-1-13 14:58:36)

  我做的是issr标记，我模板的量大多在60ng左右，体系用的是takela的试剂，迫切希望得到帮助

• rxcc33 (2015-1-13 14:59:23)

  是不是跟胶的浓度有关？你的胶浓度较高啊，是分离小片段的吧。我也是新手，只是考虑到这里了，希望对你有帮助。
  

• 969 (2015-1-13 15:00:28)

  我跑了很多聚丙烯酰胺的胶，都是8%的浓度，52孔的，带型很漂亮

• cocacola (2015-1-13 15:01:13)

  亮度一定程度反映了浓度，你要是有功夫就得优化PCR，让各个引物产物平衡一点。没功夫就少上点样就行了，曝光再调低点，能基本看清楚就行了。你看现在的marker也很亮，1.5的胶浓度差不多

• orangecake (2015-1-13 15:01:38)

  QUOTE:

  原帖由 cocacola 于 2015-1-13 15:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  亮度一定程度反映了浓度，你要是有功夫就得优化PCR，让各个引物产物平衡一点。没功夫就少上点样就行了，曝光再调低点，能基本看清楚就行了。你看现在的marker也很亮，1.5的胶浓度差不多 ...

  谢谢您，我的上样量是10微升，我就是想得到那种根根分明的条带，好像我的条带还有点模糊，有点弥散啊，是怎么回事呢？

• tianmei001 (2015-1-13 15:02:11)

  
  我也遇到过同样的情况 一般我考虑引物不特异 扩出 很多杂带 还有就是提高退火温度 让杂带减少 你的还可以看出有杂带 我的测序才知道有杂带 慢慢来 先优化看看 祝你好运 实验就是这样 加油！
  

• vera+ (2015-1-13 15:02:53)

  提高退火温度，减少非特异性条带；增加胶浓度或转用PAGE胶；减少上样量5ul试试。祝好运……

• october7 (2015-1-13 15:07:21)

  
  非特异性扩增太多了吧

• pou (2015-1-13 15:16:10)

  
  非特异太严重了啊 都跑出Marker了

• orangecake (2015-1-13 15:18:43)

  QUOTE:

  原帖由 pou 于 2015-1-13 15:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  非特异太严重了啊 都跑出Marker了

  谢谢您，我刚刚做分子实验，怎样看就是非特异性扩增呢？那我要怎样才能减少这个非特异性扩增呢？我也觉得我的条带好像太多了。

• ENA (2015-1-13 15:19:07)

  
  可以优化一下引物，适当减少模板的量。可以延长一下跑胶时间，条带会跑的更开一些。

• glass (2015-1-13 15:19:55)

  导致非特异性扩增的原因一般为以下几点：
  1. 50l反应体系，基因组DNA的优化用量是0.1~1ug，从图上看，你的模版用量偏高。
  2. 镁离子浓度过高，常规PCR从1.5mM开始优化。
  3.退火温度偏低，有条件的话可以用梯度循环仪优化退火温度，不行就逐步优化，每次1~2度。
  4.引物浓度偏高也会引起错配和非特异性扩增，且可增加形成引物二聚体的机会。
  5.50ul体系，Taq酶用量为1~1.5U，当反应混合物中含有抑制剂时，需增加用量至2~3U。
  此外，循环数影响条带亮度，一般25~35个循环为宜，你可以做30个循环的试试。

• 9妖9 (2015-1-13 15:20:11)

  
  适当调低胶浓度，上样量改为6-8，增加电泳时间。。。
  

• summerxx (2015-1-13 15:20:40)

  
  适当调低胶浓度，上样量改为6-8，增加电泳时间。。。
  

• ritou1985 (2015-1-13 15:21:43)

  上样量太多了，试试减少点染料

• birdfish (2015-1-13 15:21:59)

  不要点太多，你试试3微升左右

• leifengta (2015-1-13 15:22:58)

  谢谢您，我的上样量是10微升，我就是想得到那种根根分明的条带，好像我的条带还有点模糊，有点弥散啊，是 ...
  
  ===========================
  
  我胶的浓度是8%，上样量2微升。

• orangecake (2015-1-13 15:23:38)

  QUOTE:

  原帖由 birdfish 于 2015-1-13 15:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  不要点太多，你试试3微升左右

  3ul也可以吗？我们实验室也有个做issr的，我看她上了10ul，由于我刚刚接触这个，也跟着点了10ul，我点过6ul的，可是效果还是不乐观，那我试试你说的3ul吧，谢谢您的帮助呀！我也是第一次听说可以减少到3ul的。

• orangecake (2015-1-13 15:24:05)

  QUOTE:

  原帖由 ritou1985 于 2015-1-13 15:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  上样量太多了，试试减少点染料

  您说的减少点染料是指溴酚蓝吗，我是20ul的体系，我加了4ul的溴酚蓝，不知道会不会太多了，谢谢您的帮助！
  

• cocacola (2015-1-13 15:26:33)

  上样量太多吧！另外想分的更开可以用长胶跑嘛