哥大闵玮组：新型显微术突破传统光学成像的颜色极限
生命科学研究水平的发展很大程度上要归功于新型研究手段和生物技术的创新。其中，光学成像技术贯穿了生命科学研究的历史与未来。上至17世纪列文虎克利用显微镜开创了微生物学，下到如今已经广泛应用的荧光共聚焦显微镜，这个领域的每一次技术突破都极大地增强了人们认识微观世界的能力。近年来，光学显微镜技术在不断地突破自身的局限。例如2000年以来兴起的超分辨荧光成像技术，已经突破了光学衍射极限。时至今日，人类进入大数据和系统生物学时代，另一个日益显著的挑战摆在眼前：在复杂的生物系统中，如何对多种组分进行无损，快速，高灵敏度的同时成像？传统的荧光成像方法中，由于其探针发射光谱有较宽的宽度（～50nm），可见光波长区最多可以容纳5种颜色。正因为此，最多5种生物组分能被同时成像。要想在复杂体系里根本性地突破这个“颜色极限”，需要寻求全新的光谱学手段以及发展相应的特异性探针系列。
美国哥伦比亚大学化学系闵玮教授的团队近日报道了一种全新的成像技术：电子预共振受激拉曼散射显微镜（Electronic Pre-Resonance Stimulated Raman Scattering Microscopy）。该技术结合了拉曼散射光谱窄（～1nm）以及荧光分析灵敏度高的优点。结合荧光成像技术，作者报导了24种颜色各异的探针，展示了多达16种颜色的活细胞成像和8种颜色的脑组织成像。这项工作近期发表于Nature上。
电子预共振受激拉曼散射是拉曼散射的一种特殊形式。拉曼散射信号通常很微弱，受激拉曼散射通过两束满足共振条件泵浦和斯托克斯激光与分子特定振动发生特异性耦合来增强信号。受激拉曼散射和生物成像的结合自2008年被哈佛大学谢晓亮教授在Science杂志报导以来（Science, 2008, 322, 1857-1861；闵玮教授也是该技术的主要发明人），已经被广泛应用在生命分析研究中。电子共振拉曼散射则是另一种增强拉曼信号的方法：当泵浦激光的频率接近分子的电子能级跃迁频率（即吸收波长）时，与电子能级跃迁耦合相关的分子振动光谱也被选择性增强。因此，将电子共振拉曼散射和受激拉曼散射结合，可以极大地提升拉曼信号。然而当泵浦激光频率严格等于分子的电子能级跃迁频率时，分子不但会经历电子共振受激拉曼散射，同时也有其他的泵浦-探测过程干扰检测信号。作者发现，当泵浦激光频率略低于分子的电子能级跃迁频率（实验发现与分子吸收峰相差2100波数左右）时，可以在实现最大的信号增强的同时，避免检测背景的干扰。这项技术就是电子预共振受激拉曼散射，可以将以前普遍使用的无共振的受激拉曼散射信号提升1000倍左右，1毫秒内的对应检出限在250nm，从而可以胜任大部分生物分子的成像分析。
接下来，闵教授团队着力于寻找和开发合适的分子探针。由于选用的泵浦激光器波长在900nm左右，其对应的预共振拉曼探针吸收波长在650-750nm时，可以实现最佳的信号提升。这个波长段的商用分子探针，如Alexa647、Atto740等，都在C=C碳碳双键区间显示了特征的预共振拉曼谱。利用5种商用分子探针的预共振拉曼散射并结合3种荧光探针，作者实现了8种颜色的活细胞成像。为了进一步克服碳碳双键区间波段非常拥挤的缺点，作者创新地发明和发展了一系列含有炔基（碳碳三键）和氰基（碳氮三键）的分子探针。由于炔基和氰基的拉曼振动在无干扰的2000-2300cm-1区间有单一的特征频率，且与生物体内常见基团有显著区别，该区间的拉曼探针可以比在拥挤的“指纹区”实现更多的“颜色”。作者结合了同位素标记和结构修饰等策略，合成了28种吸收在650-750nm、三键振动频率在2000-2300cm-1的新型预共振拉曼探针。作者为他们取名为Manhattan Raman Scattering（MARS）调色板。
最后作者通过神经细胞和大脑切片的成像，展示了预共振受激拉曼散射显微镜及其相应探针技术在生命科学研究中的潜力。作者对小鼠海马体神经细胞进行了体外培养，并用免疫标记的方法标记了5种不同的标志蛋白，用两种正交的代谢标记对细胞内新合成的蛋白质进行脉冲-追踪实验，并用DNA染料确定细胞核的位置。通过对8种“颜色”的细胞图像进行交叉对比分析，作者观察到新生成的包涵体主要是由新合成的蛋白质构成。而星形胶质细胞中的内涵体远多于神经元细胞。作者认为这个实验支持了一个假说：星形胶质细胞可以将新合成的折叠错误的蛋白质隔离进入包涵体来减弱他们的毒性，然而神经元细胞没有这种能力，因此对蛋白质调控的错乱更加没有耐受性。
在闵玮课题组看来，预共振受激拉曼散射显微镜技术的发明，不但体现了课题组在振动光谱生物成像方向上十余年的积累，也彰显了学科交叉的重要性。该项技术本身就可以看成是振动光谱与吸收光谱的协同，而发明过程也体现了新型显微镜技术与分子探针的完美结合。文章的第一作者魏璐（Lu Wei）博士是2017年美国化学会物理化学博士后奖得主，主导了预共振受激拉曼光谱学以及成像部分和神经生物学部分的工作，将于2018年在加州理工大学独立领导实验室。文章的第二作者陈知行（Zhixing Chen）博士和合作者共同完成了预共振受激拉曼探针的合成和表征。对于这项技术的未来应用，闵玮课题组表示非常乐观，相信预共振受激拉曼散射显微镜技术的发展可以使得科学工作者观测和分析复杂生命体系变得更加容易，给神经生物学，肿瘤病理，微生物组学等方向的研究带来助力。
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