哎！
1. 不需要浸泡！！！（大家不要忽悠人了，好不！？）
甲醇全湿30sec，转膜液1分钟即可，但你要晃动晃动膜，保证上下表面都完全沾到转膜液即可。
2. 完全没必要用立春红染色。膜上可以看到marker，你已经转成功了。
为啥出现差异！？——这个结果已经说明立春红染色是多么stupid的步骤。
A. 现在多数实验室已经用预染的Marker做实验，转膜情况如何只需要看看Marker的深浅。B.增加一轮漂洗的操作，对膜和膜上的蛋白并不好。C. 浪费时间。如果可以直接看Marker深浅指示转膜效果，何必再多此一举！？（我在别的帖子上回的，copy过来）
NC膜由于带负电荷更易吸附蛋白，所以常规情况下，NC膜的转膜效率会显著高于PVDF，达到了立春红的识别的区间，所以出现条带。但你能说10KDa左右的没转过去吗！？——浓度！浓度！超出识别的阈值了！！！
其实你没必要割成两张膜转膜（当然如果你想省钱例外）；你自己都说了，预染marker转过去了，So just Continue, What r u waiting for!???
我推测你提问的原因是后面出现问题了（如果是我肯定不管3721继续做下去），所以会担心转膜有问题。但我明确告诉你转膜没问题，那么哪儿有问题呢？估计你们的WB体系是根据NC膜构建的，这套体系不太适合PVDF。——为啥？
还是上文提到的NC膜吸附蛋白能力强，同样非特异性吸附抗体的能力也强（抗体也是蛋白），所以NC膜通常用高盐漂洗除背景，而高盐对抗体和PVDF都不是很合适的条件，所以如果你要启用PVDF膜，就必须另配一套WB缓冲液体系（封闭液例外，但通常封闭液就是抗体稀释液，而抗体稀释液最好不要用高盐的，在你没试验过可行性之前）
PS：不否认浸泡膜会对转膜有好处，但又不是难转的蛋白，何必多此一举，多此一举！
用NC膜可以；Tat我们这么干的。
marker过去了就一定是转膜成功了，这个没问题。其实考虑改小孔径转膜无非顾虑转膜过度，你还担心转膜不够！？而且事实上我们转HIV Tat蛋白（86aa，p14）也只是用普通的0.45um pvdf，何况你还是用0.22um的。
对，我前面提过了，你有没有办法确定你的抗体没问题，if u sure Ab is ok，那么就是因为我告诉你的NC膜这套WB体系和PVDF膜的不兼容，你可以用PVDF的WB体系去做NC膜的WB（背景会升高），反过来不一定。
PS：你首先还需要确定Ab能不能用高盐抗体缓冲液稀释，高盐会破坏蛋白的空间结构。所以NC体系没问题的，PVDF体系都没问题，反过来就是不一定。
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glass (2014-2-22 23:06:40)
pvdf膜转膜前需要比较严格的处理程序，包括用甲醇浸泡20min后再用转膜缓冲液浸泡等等，你可以在网上查查pvdf膜处理的程序再看看
小野花 (2014-2-22 23:07:02)
谢谢，我现在要做10kd蛋白的WB,想请教下，电泳，转膜的条件，以及需要注意些什么？
feima+ (2014-2-22 23:08:58)
1.转PVDF膜时,首先膜要先用甲醇浸泡,浸泡时间一般是1-20分钟,我用的是5分钟,甲醇浸泡后用转移液浸泡,浸泡时间我用的是比较长,我一般是用两小时,就是早早的就把转移液放到盘子里,海绵,滤纸也都放到里面.把PVDF膜泡透是比较重要的一步.
2.转移液要经常换新的,一般认为转移液可以用3-5次,但是我都是用两次就换新的,感觉次数多了.就不好用了,容易导致转膜的时候转不上,或者使膜上的蛋白条带发生弯曲,偏移,分散.
3.转膜的时候容易产热,所以转移槽里面最好加冰槽.我是里面加兵槽,外面用冰围起来(把转移的装置放在塑料脸盆中).这样的转移效果比较好.我用的是MILIPORE 的PVDF膜 ,我用的转移时间是300毫安半小时.当然膜不同,转移装置不同,所用的转移时间也可能不同.
4.还有很重要的一点就是,当膜上染色没染出来时,暴光的时候也可能出现条带,只是条带可能比较弱,暴光时间要长一点.
greenbee (2014-2-22 23:09:55)
我转膜的时候根据预染Marker,我刚开始摸条件都是用两张膜，一两次就能摸出条件了，你试试。我测的是36kD，100V，1h，电流在200-400mA。
小野花 (2014-2-22 23:10:46)
小野花 (2014-2-22 23:11:37)
今天将pvdf膜在甲醇中浸泡20分中，然后放入转膜缓冲液中浸泡20分钟，再进行转膜，结果膜上可以看到maker，但是用丽春红染膜，8－16kd间未见任何蛋白条带，而同时用NC膜转的30－50kd之间均可见蛋白条带，请问这是什么原因啊？
quiqui008 (2014-2-22 23:12:18)
哎！
1. 不需要浸泡！！！（大家不要忽悠人了，好不！？）
甲醇全湿30sec，转膜液1分钟即可，但你要晃动晃动膜，保证上下表面都完全沾到转膜液即可。
2. 完全没必要用立春红染色。膜上可以看到marker，你已经转成功了。
为啥出现差异！？——这个结果已经说明立春红染色是多么stupid的步骤。
A. 现在多数实验室已经用预染的Marker做实验，转膜情况如何只需要看看Marker的深浅。B.增加一轮漂洗的操作，对膜和膜上的蛋白并不好。C. 浪费时间。如果可以直接看Marker深浅指示转膜效果，何必再多此一举！？（我在别的帖子上回的，copy过来）
NC膜由于带负电荷更易吸附蛋白，所以常规情况下，NC膜的转膜效率会显著高于PVDF，达到了立春红的识别的区间，所以出现条带。但你能说10KDa左右的没转过去吗！？——浓度！浓度！超出识别的阈值了！！！
其实你没必要割成两张膜转膜（当然如果你想省钱例外）；你自己都说了，预染marker转过去了，So just Continue, What r u waiting for!???
我推测你提问的原因是后面出现问题了（如果是我肯定不管3721继续做下去），所以会担心转膜有问题。但我明确告诉你转膜没问题，那么哪儿有问题呢？估计你们的WB体系是根据NC膜构建的，这套体系不太适合PVDF。——为啥？
还是上文提到的NC膜吸附蛋白能力强，同样非特异性吸附抗体的能力也强（抗体也是蛋白），所以NC膜通常用高盐漂洗除背景，而高盐对抗体和PVDF都不是很合适的条件，所以如果你要启用PVDF膜，就必须另配一套WB缓冲液体系（封闭液例外，但通常封闭液就是抗体稀释液，而抗体稀释液最好不要用高盐的，在你没试验过可行性之前）
PS：不否认浸泡膜会对转膜有好处，但又不是难转的蛋白，何必多此一举，多此一举！
小野花 (2014-2-22 23:13:00)
1、预染marker在膜上可见，就说明转膜成功了吗？
2、我做的目的蛋白10kd左右，很多资料上说需要用0.22um 的pvdf膜，我想问下，可以用NC膜嘛？
3、 今天用ECL发光，内参（43kd)可以看见蛋白条带光，目的(10kd）未见，然后曝光10min，显影、定影各2min，未见蛋白条带。请问下什么原因？是显影的问题吗？
feima+ (2014-2-22 23:13:59)
用NC膜可以；Tat我们这么干的。
marker过去了就一定是转膜成功了，这个没问题。其实考虑改小孔径转膜无非顾虑转膜过度，你还担心转膜不够！？而且事实上我们转HIV Tat蛋白（86aa，p14）也只是用普通的0.45um pvdf，何况你还是用0.22um的。
对，我前面提过了，你有没有办法确定你的抗体没问题，if u sure Ab is ok，那么就是因为我告诉你的NC膜这套WB体系和PVDF膜的不兼容，你可以用PVDF的WB体系去做NC膜的WB（背景会升高），反过来不一定。
PS：你首先还需要确定Ab能不能用高盐抗体缓冲液稀释，高盐会破坏蛋白的空间结构。所以NC体系没问题的，PVDF体系都没问题，反过来就是不一定。
yes4 (2014-2-22 23:14:26)
转移缓冲液：3.03g tris，14.4g甘氨酸，用去离子水定容为800毫升，再加200毫升甲醇
小野花 (2014-2-22 23:15:07)
用ECL发光，内参（43kd)可以看见蛋白条带光，目的(10kd）未见，然后曝光10min，显影、定影各2min，未见蛋白条带。请问下什么原因？是显影的问题吗？
jiushikeshui371 (2014-2-22 23:15:56)
1. 背景如何呢？whatever，提高一抗的浓度，2倍，4倍，先不考虑背景，整出条带来再说。
2. 你要告诉我们你的抗体稀释液NaCl浓度，我上文提过多次高盐影响抗体蛋白的空间结构，而你一开口就提到NC膜，我猜测你的抗体稀释液盐浓度很高，包括后面的washing buff.，如果目前你用的是0.15M的，那么就按第一条的办。还不行测试你的抗体是否可用。
测试抗体：A. 有目的pro的质粒，做转染、IP、WB（GST的，直接WB就好）。B. 商品化蛋白做WB。C. 有没有途径增强表达，若磷酸化增强磷酸化，总之让信号强点，看看抗体可用不？
抗体不work太常见了。
小野花 (2014-2-22 23:16:28)
抗体稀释是用的5%脱脂奶粉，用TBST溶解。Nacl浓度为0.15Mol/L,抗体已经提高到说明书上推荐浓度的2倍，但还是没有出来条带。困惑中~~~
还有就是用ECL发光，内参（43kd)可以看见蛋白条带光，然后曝光压片10min，显影、定影各2min，未见蛋白条带。请问下什么原因？是显影的问题吗？
bluelake (2014-2-22 23:16:56)
恩，TBST的体系呀，在NC膜上一般非特异很强，背景高。
淬灭吗！原因吗，cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=11405201&sty=1')（应该写得够全面的，当然具体过程还是复杂些）
你应该是我说的第一个原因，抗原过强，HRP瞬间die型（一再证明你的转膜没问题了吧）；当然也可能是污染型，你的保鲜膜啦，底片夹啦，总之有个东西非常非常脏，因为一点点脏只是局部淬灭，或者一大滴水滴进去了，包括污水如显影液、定影液；最后可能是漏液型，ECL渗光，这后面两个原因通常多少都有点信号，所以可能性小。
建议：
1. 如果是抗原过多，减少上样量。
2. 污染呢，如果不是很脏，那么建议你换个牌子的保鲜膜，质量要好些的，这很重要！
PS：很奇怪你压片前不再肉眼检查的吗！？你包好保鲜膜，放到压片夹，这些操作怎么也要3-5min，然后肉眼看一下，再放底片合上夹子。你不看就扔底片，我们很难分析原因的。有时候一放到保鲜膜上就彻底没信号了，保鲜膜干净也没破，那就是保鲜膜质量不合格，不知道残留什么看不见的化学物质。
PS2：脱脂牛奶的质量很难说，主要不清楚你们lab其他人别的抗体如何，如果他们的没问题，那么这个不是问题。总之国内的脱脂牛奶很垃圾，国外的太贵或买不到，早不用这个了。
阿凡提 (2014-2-22 23:18:46)
请问，我可以看到大分子量的marker，但是看不到小分子量的marker，只是为什么啊，我半干转50分钟，是转膜时间长吗，还是没转过去啊。
jujuba (2014-2-22 23:19:04)
NC膜的WB体系和PVDF膜的有什么不同啊
【求助】转膜问题，急！