【求助】定点突变

最新回复

• bongte (2015-3-10 17:42:09)

  
  不好意思，没太看懂你的图，哪个部分点突变？中间部分？

• prettygirl@ (2015-3-10 17:42:26)

  这个图，是有两个突变点
  设计3对引物，引物引进了正确的碱基，然后分别扩增出这3段，再利用同源重组把这几段拼接起来。

• bongte (2015-3-10 17:43:03)

  QUOTE:

  原帖由 prettygirl@ 于 2015-3-10 17:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  这个图，是有两个突变点
  设计3对引物，引物引进了正确的碱基，然后分别扩增出这3段，再利用同源重组把这几段拼接起来。

  哦，你1楼说有1个点突变。。
  扩增3次，再同源重组？你的工作量挺大啊，而且风险也不小。
  
  没有变回来应该是没有同源重组

• prettygirl@ (2015-3-10 17:43:23)

  QUOTE:

  原帖由 bongte 于 2015-3-10 17:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  哦，你1楼说有1个点突变。。
  扩增3次，再同源重组？你的工作量挺大啊，而且风险也不小。
  
  没有变回来应该是没有同源重组

  我在做2个基因，一个基因一个突变，一个2个突变。所以一个突变的是要扩增2段在和酶切开的质粒重组。二个突变的是扩增3段和酶切开的重组。理论是这个样子的，说明书上也是这样说的长出的克隆是95% 是要的。可是板上没找到一个是变回来的克隆。

• DNA (2015-3-10 17:43:42)

  QUOTE:

  原帖由 prettygirl@ 于 2015-3-10 17:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  我在做2个基因，一个基因一个突变，一个2个突变。所以一个突变的是要扩增2段在和酶切开的质粒重组。二个突变的是扩增3段和酶切开的重组。理论是这个样子的，说明书上也是这样说的长出的克隆是95% 是要的。可是板上没找到 ...

  那你筛选呢？只能测序？

• prettygirl@ (2015-3-10 17:44:00)

  QUOTE:

  原帖由 DNA 于 2015-3-10 17:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  那你筛选呢？只能测序？

  是呀，就是先挑大小是我要的质粒，然后送测序呀

• tuomu45 (2015-3-10 17:44:15)

  工作量大，风险系数高不支持。

• 鸽子不哭 (2015-3-10 17:44:35)

  你能挑到片断大小符合预期的,说明连接效率和片断组装都很成功. 唯一可能的原因是你的突变PCR没有做好,突变位点没有引入PCR产物. 可能的原因是:
  1. 引物设计有问题.突变为点建议在中间,不能在靠近3'末端,因为Pfu有外切功能
  2. 引物合成必须用PAGE纯化. 现在引物合成的质量参差不齐, 必须要用PAGE纯化的才能保证结果
  
  如果突变PCR做好,那基本是没有问题的.