【求助】定点突变

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【求助】定点突变
谁用过GB-Mut定向突变试剂盒做定点突变?
我最近做是都没有变回来。我的基因长3kb,质粒4kb,共7kb,有一个点突变,设计引物按要求来的,可是没有变回来。求解
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最新回复

  • bongte (2015-3-10 17:42:09)


    不好意思,没太看懂你的图,哪个部分点突变?中间部分?
  • prettygirl@ (2015-3-10 17:42:26)

    这个图,是有两个突变点
    设计3对引物,引物引进了正确的碱基,然后分别扩增出这3段,再利用同源重组把这几段拼接起来。
  • bongte (2015-3-10 17:43:03)

    QUOTE:

    原帖由 prettygirl@ 于 2015-3-10 17:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
    这个图,是有两个突变点
    设计3对引物,引物引进了正确的碱基,然后分别扩增出这3段,再利用同源重组把这几段拼接起来。
    哦,你1楼说有1个点突变。。
    扩增3次,再同源重组?你的工作量挺大啊,而且风险也不小。

    没有变回来应该是没有同源重组
  • prettygirl@ (2015-3-10 17:43:23)

    QUOTE:

    原帖由 bongte 于 2015-3-10 17:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    哦,你1楼说有1个点突变。。
    扩增3次,再同源重组?你的工作量挺大啊,而且风险也不小。

    没有变回来应该是没有同源重组
    我在做2个基因,一个基因一个突变,一个2个突变。所以一个突变的是要扩增2段在和酶切开的质粒重组。二个突变的是扩增3段和酶切开的重组。理论是这个样子的,说明书上也是这样说的长出的克隆是95% 是要的。可是板上没找到一个是变回来的克隆。
  • DNA (2015-3-10 17:43:42)

    QUOTE:

    原帖由 prettygirl@ 于 2015-3-10 17:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    我在做2个基因,一个基因一个突变,一个2个突变。所以一个突变的是要扩增2段在和酶切开的质粒重组。二个突变的是扩增3段和酶切开的重组。理论是这个样子的,说明书上也是这样说的长出的克隆是95% 是要的。可是板上没找到 ...
    那你筛选呢?只能测序?
  • prettygirl@ (2015-3-10 17:44:00)

    QUOTE:

    原帖由 DNA 于 2015-3-10 17:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    那你筛选呢?只能测序?
    是呀,就是先挑大小是我要的质粒,然后送测序呀
  • tuomu45 (2015-3-10 17:44:15)

    工作量大,风险系数高不支持。
  • 鸽子不哭 (2015-3-10 17:44:35)

    你能挑到片断大小符合预期的,说明连接效率和片断组装都很成功. 唯一可能的原因是你的突变PCR没有做好,突变位点没有引入PCR产物. 可能的原因是:
    1. 引物设计有问题.突变为点建议在中间,不能在靠近3'末端,因为Pfu有外切功能
    2. 引物合成必须用PAGE纯化. 现在引物合成的质量参差不齐, 必须要用PAGE纯化的才能保证结果

    如果突变PCR做好,那基本是没有问题的.
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