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尿17-酮类固醇测定(一)
关键词:一级标准物质 农残检测尿17-酮类固醇测定(一)
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【实验原理】
17-酮类固醇(17-ketosteroids,17-KS)是肾上腺皮质激素及雄性激素的代谢产物,它们都是环戊烷多氢菲的衍生物,在第17位碳原子上都有一酮基。这类化合物主要为雄酮、表雄酮、去氢表雄酮和原胆烷醇酮等,大部分结合成为水溶性的葡萄糖醛酸酯或硫酸酯。17-KS必须经过酸水解成游离的类固醇后,再用有机溶剂提取,经过洗涤除去酸类与酚类物质,利用17-KS分子结构中酮-亚甲基(一CO—CH2一)能在碱性溶液中与问二硝基苯作用生成紫红色化合物(Zimmermann反应),在520nm波长处有一吸收峰,可与标准液同时操作进行比色测定。
【试剂与器材】
1.浓盐酸(AR)
2.乙醚(AR)
3.去醛乙醇无水乙醇1000ml,加入4g盐酸问苯二胺,充分混匀后,暗处静置1周,每天振摇2次,到期进行蒸馏,弃去开始馏出与最后剩余部分各50ml,收集中间部分所得乙醇,置棕色瓶中保存。 ’
4.0.12mol/L间二硝基苯乙醇溶液称取纯化的间二硝基苯2g,溶于去醛无水乙醇内,定容至100ml。冰箱避光保存。
间二硝基苯必须重结晶提纯,处理方法如下:取间二硝基苯20g,加95%乙醇150ml,加温至40℃,使其溶解。加2mol/L NaOH溶液100ml,静置5分钟。在室温下徐徐加蒸馏水2500ml,边加边摇,静置即可出现针状白色结晶,用布氏漏斗收集沉淀,并用蒸馏水洗涤后吸干,沉淀用无水乙醇80~120ml再结晶2次,纯化的结晶洁白无色,熔点90.5~9l℃。
5.100μg/ml雄酮标准溶液将雄酮(GR)置于干燥器中至少48小时,精确称取雄酮10mg,置于100ml容量瓶中,用去醛乙醇溶解并定容。此液不能久存,必须分装于洁净的中号试管中,每管0.2ml(含20μg),置37℃温箱中烘干,置暗处保存,每次测定时取出一管使用。
6.5mol/LKOH溶液
7.70%去醛乙醇溶液取去醛乙醇70ml,加蒸馏水至100ml。
8.2mol/L NaOH溶液
9.仪器分光光度计。
【操作步骤】
1.标本收集 收集24小时尿液于洁净的容器中,预加浓盐酸5ml防腐,并记录尿液总量。
2.水解 取24小时混合尿液5ml,置试管中,加浓盐酸1.5ml,在沸水中煮沸20分钟,取出,置冷水中冷却。
3.提取 将上述水解液倒入30m1分液漏斗中,加乙醚约10ml,振摇2分钟,静置分层以后,弃下层尿液,加5ml 2mol/L NaOH于分液漏斗中,振摇1分钟,以除去酸性酚类干扰物质,静置分层后,弃去下层NaOH液,再加蒸馏水5ml洗涤2次,弃去下层水液,于40~45℃水浴中蒸干。此管即为测定管。
4.标准管 取上述分装于15mm×150mm试管中烘干的标准管一支作标准管。
5.显色 取测定管、标准管、空白管3支试管
各管混匀,1000r/min离心5分钟,上层液移入比色杯中,在波长520nm处,以空白管调零,读取各管的吸光度。
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