PacBio SMRT测序技术揭示第七次霍乱大流行致病菌的来源
霍乱是一种由霍乱弧菌引起的可怕疾病。在人类历史上，自1817年以来，全球曾发生过七次可怕的霍乱大流行。而离我们最近的第七次霍乱大流行起始于1961至今，发源地是印度尼西亚，由此逐渐散布到了全世界。到目前为止，第七次霍乱大流行已经感染的人数大概在每年300-500万人左右。2010年海地地震后，霍乱也出现了一次大的爆发，导致近70万人感染，超过8500人死亡。
图1，霍乱弧菌（来自bacteriainphotos.com）
对于这样一个极具历史意义的细菌性传染性疾病，现代科学技术能够研究的致病菌只有第六次（1899-1923）和第七次（1961至今）霍乱大流行。通过血清学分析，第六次由经典型（classical）引起，而第七由El Tor型引起。而经过基因组分析进化树，发现除第七次大流行外，其他几次的霍乱菌全部来源于同一个classical型。这也说明第七次大流行并不是由第六次大流行的菌株直接演变而来的。
在今天向大家介绍的文章中，作者基于高质量的全基因组测序，对当前所有第七次流行的菌株，包括第七次大流行开始时分离的菌株进行了分析，建立了一个高质量的系统发生树，描绘了发生遗传变化的六个阶段，并得到了三个清晰的生态型，其中包括了非致病性的环境性霍乱弧菌。而第七次大流行霍乱菌株的进化包括了一些获得性基因介导的重要变化，而这些基因被认为是来源于环境中的霍乱弧菌，并且在第六次大流行的菌株中也出现过。这说明此前致病性的霍乱弧菌对第七次大流行的霍乱弧菌致病性的形成与进化有着重要的作用。
图2：导致第七次大流行菌株的六个阶段。在每个分支上展示了遗传事件的变化的细节。
从以往可用于分析的菌株、包括第七次大流行菌株来看，其研究却是有局限性的。尽管作者对其中一个菌株（M66-2）进行了完整的基因组测序，并鉴定了一些在形成第七次霍乱大流行菌株过程中的变异事件，但其他的流行性霍乱菌株的基因组信息则相当匮乏，仅有一些菌株的草图。为了阐明第七次大流行菌株的起源和从第六到第七次大流行的过渡，作者使用PacBio测序技术进行了10个菌株的完整基因组测序，包括来源于中东和孟加锡的3个流行前菌株和4个非常早期（1961-1964年）的第七次大流行菌株，另外还有三个来源于美国（1974年）、澳大利亚（1977年）、中国（1974年）的流行前菌株。
表1， 本次研究涉及到的霍乱弧菌测序结果
*标记为作者进行全基因组测序的菌株
在进行PacBio SMRT测序过程中，作者针对每一个待测的菌株，构建了10kb文库，采用P4-C2测序试剂进行单分子测序，并用HGAP/Quiver软件进行了de novo组装，形成高质量的完整的基因组。随后，作者还进行了SNP检测以及进化分析，基因组注释和比较基因组学分析。在分析过程中，质量更好的全基因组序列信息能够帮助识别所有的插入缺失片段。
图3，基于排除重组事件后变异差异的21株霍乱弧菌的最大似然进化树。包括突变、插入缺失、重组等遗传事件标注于各个分支上。但由于MAK757, NCTC8457, BX330286, 以及2740-80分支缺乏有效的序列数据，因此没有做具体的分析。
图4，具有完整的基因组序列的8个霍乱弧菌菌株在主要谱系的进化树，图中每个分支中所有的遗传事件都在括号中表示，包括各种大小的插入缺失等。
在以往报道中提到，第七次大流行菌株中几乎没有重组事件。在本次研究中，也同样发现，该菌株重组事件频率非常低，但却发生了许多突变。本文中，作者认为在第七次大流行及其爆发的过程中，菌株中的低重组频率，简单来说，可能是由于霍乱弧菌在大流行期间在环境中经历的时间较少，在生物进入水体后不久即可发生感染，使得重组的机会大大减少。而低重组率可以使它们进入长期稳定的VBNC（viable but noncultivable）状态，然后在合适条件下再次进入活性生长状态从而感染宿主。因而作者通过高质量的全基因组分析发现，导致人类腹泻的霍乱弧菌并不能与环境中的霍乱弧菌发生重组。
在本文中，为了更加全面的分析不同时期采集的霍乱弧菌样本，需要高质量的全基因组数据，从而更直接的得到突变、插入缺失、重组等遗事件的全方位信息。因此作者利用PacBio SMRT测序技术，分析并比对了进化树中各个分支上的所有遗传事件，揭示了针对目前可能的第七次大流行的霍乱菌株的进化史，为该领域提供了一个最清晰的视角。
原文信息
Hu D, Liu B, Feng L, et al. Origins of the current seventh cholera pandemic[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2016: 201608732.
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