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【讨论帖】有关异源表达的讨论
【讨论帖】有关异源表达的讨论
异源蛋白的表达是个很复杂的问题，有许许多多的影响因素，而且由于蛋白本身千差万别，很难有一个很完善或很标准的流程方法。
另外，表达的宿主也是多种多样，目前比较常用的包括E.coli，酵母（以甲醇酵母居多），昆虫细胞，哺乳动物细胞等，各自有着其本身的特点，优缺点各异。
但是，异源表达又是分子生物学中很重要的一个工具，论坛里不少战友都在做这方面的工作，许多帖子在讨论这方面的问题。因此想发起一个针对这方面的专题讨论，希望有助于大家的工作，当然也希望能对自己的工作有所帮助，欢迎大家讨论。
还有，由于本人只做了有关E.coli和甲醇酵母的工作，其他虽然我们研究所也有人做，但毕竟本身没做过，若有错误或不严谨的地方欢迎战友们指正。
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windy+++ (2013-12-07 22:21:14)
首先在这里提出几方面问题，希望大家讨论：
1. 宿主的选择。
表达宿主虽众多，但比较常用的也就E.coli，酵母（以甲醇酵母居多），昆虫细胞，哺乳动物细胞等，各自代表了一种体系。
E.coli 原核宿主，无翻译后修饰。但周期短、费用低、表达量大，一直是最常用的宿主之一。蛋白一般很好表达，量很大，但很可能由于蛋白的翻译后修饰不完善而没有活性(或形成包涵体)，尤其是表达真核蛋白时最应注意。
酵母，有了比较完备的翻译后修饰系统，尤其是糖基化。但是个人感觉酵母表达异源蛋白时对蛋白本身的特点要求很大，有的蛋白表达量非常大，有的却几乎一点也没有，很折磨人。
昆虫细胞和动物细胞本人没有做过，但园子里也有很详细的介绍，搜一下google也有不少，其中还有许多是画成了表格，对比各自的优缺点，网络不好，没找链接，希望有人可以不全，多谢多谢！
另外，也有很多用链霉菌表达的成功实例，不过个人感觉链霉做起来相当麻烦，周期长，转化困难，表达量也没什么优势，而且翻译后修饰虽然也有，但仍与真核差别较大。不过链霉菌有许多次级代谢产物（一些小分子物质）可能比蛋白表达本身更有意义，我们实验室就有很多人在做这方面研究。
windy+++ (2013-12-07 22:21:38)
转化子的筛选，由于许多质粒是穿梭质粒，因此大多具有E.coli中的抗性筛选标记，筛选起来是很方便的（当然，我不清楚细胞方面的筛选，一般使用病毒载体吧，希望高手们介绍一下）。
但是转化成功的并不意味着能够成功表达目的蛋白了，因此还需要“表达子”的筛选，尤其是整合入基因组的片断（E.coli一般是游离质粒表达，好像不用再筛选了，有就有，没有就没有了）。我做的是毕赤酵母(GS115,pPIC9k)，在筛选过程中遇到了不小的问题，一般如果目的蛋白有些容易检测的特殊活性（比如抑菌活性），则筛选起来是比较容易的。但是如果没有，由于酵母是整合入基因组表达的，就不太好说了，我用原位点杂交的方法筛选过，效果不好，但筛选量倒挺大；还有就是5ml小量发酵筛选，工作量就比较大了，而且筛了400-500个也没有。
还有就是发现不同的筛选方法获得的阳性菌株好像不是很平行，将上述筛到的菌株放大到100ml时就没有了。请教师兄，他说有可能是不同水平发酵溶氧量差别很大，导致酵母生长状态差异，酵母又挺娇气的，差一点也不干活，比较郁闷。不知有没有解决的方法。
不知大家有什么好的筛选方法介绍一下吧。
windy+++ (2013-12-07 22:22:14)
3. 稀有密码子
由于是异源表达，不同宿主之间其密码子的偏好性就有不少的差异，这种差异经常直接导致了异源表达的失败。下面有几个问题，我有一些看法，希望大家能给与指导和帮助。
首先，如何确定是否是该问题导致的表达失败。我的一位同学给了我个判断方法的建议，觉得很有道理，和大家分享讨论。他建议我在不同水平简单检测一下表达的情况：基因水平，做个PCR之类的看看是否已成功转入（质粒或整合入宿主）；做个半定量RT-PCR看看mRNA是否转录了；
再看看SDS-PAGE是否有蛋白表达。如果根本转化就失败了，没有什么好说的；如果基因进去了但mRNA没有表达，可能需要考虑启动子的问题，换个强启动子或干脆换个质粒；如果mRNA转录了可没有蛋白翻译，那就需要考虑是否是密码子偏好性或mRNA二级结构的问题了。
然后进一步查证，需要利用软件或上网查找是否存在这样的二级结构，以及是否含有稀有密码子影响了翻译。在这个问题上我试着查了一些网站，如cuturl('http://www.kazusa.or.jp/codon/') ；cuturl('http://gcua.schoedl.de/') ；cuturl('http://www.genebee.msu.su/cgi-bin/nph-rna2.pl')。等等。但是许多东西看不太懂，理解起来有困难。希望能有软件高手详细介绍一下用法，尤其是能分析自己片断是否含有很多稀有密码子或二级结构等。在此感谢了！
接下来就是如果确定有可能是稀有密码子问题如何解决？目前我见到的有两种方法，一是有些宿主比如大肠杆菌的Rosetta，是由BL21改造，整合了含稀有密码子tRNA的片断，使其能顺利表达的新型宿主菌，不知其他种类的宿主是否也有这种商业化的修饰菌；另外就是利用PCR等方法将片断上的稀有密码子改造（突变），换成其他编码同样氨基酸的密码子。当然，还可能干脆就换表达体系了，这一般是大家最不希望的了。
windy+++ (2013-12-07 22:22:40)
4. 菌种的保存、退化
一般来说是加甘油20%左右，-70保存；或制成干粉保存。但是在做甲醇酵母时发现了个问题，就是重组工程菌的退化现象比较严重，一般都是学生做得好好的，但是毕业以后下面的师弟一接手，蛋白就不表达了，或表达量非常的低。连续好几个师兄的结果都是如此，很是奇怪。我猜测可能是由于整合入基因组，毕竟是个外源的基因，不知整合到了染色体的什么部分，会不会过段时间就给“踢”下来，或就沉寂了？E.coli在复苏时都有抗性压着，酵母好像没有太合适的（不知pPICZ系列的那个抗生素好用不好用，但毕竟好贵
）。
我有个想法，是否也应像公司在做工程细胞时那样，挑个几十上百个，一起传代，10几代后仍然稳定表达的才说明基因整合到了合适的部位，不会再下来了？但是毕竟做研究生没那么多时间来干这个，否则万一不行毕业就困难了。有没有其他解决方法呢？盼高手。
windy+++ (2013-12-07 22:23:03)
另外，再次说一下，由于本人只做过E.coli和酵母，而且都不是太成功，仍然努力中，其他更是只看过没上手，如有不正确之处希望各位战友指正。而且我的题目是异源表达，不仅只针对我做的这两种体系，但是由于个人水平有限，只能大多局限于此，希望大家讨论补充！
windy+++ (2013-12-07 22:23:59)
对于“游离”的质粒，比如E.coli的BL21表达时，质粒的拷贝数是否对表达量有所影响？当然，由于大肠表达最主要的问题经常是表达太高了形成了包涵体，所以说白了应该希望表达量更低点的可能比较多，经常尝试各种方法（低温、低浓度IPTG等等）来降低表达量。那么BL21中的质粒是否是单拷贝的呢（没查过，不太清楚）？如果不是，能否通过降低拷贝数来降低表达量防止包涵体的形成呢？
至于酵母那种整合到基因组中的质粒，那么拷贝数是否对表达量有影响呢？通过我自己的经历，个人猜测还是有的。在上面讨论了菌种的退化问题，1年左右，重组的酵母表达蛋白就消失了。但是我曾经将这些蛋白表达消失的重组菌作了PCR鉴定，发现外源的片断仍然是存在的，就是不表达了，那么是什么原因呢？我有几种猜测：一是可能整合的位置恰好是染色体的沉寂区了，过段时间以后就沉默了，不表达了；还有一种就是会不会是原来是高拷贝的重组菌在冻存以后退化了，变成低拷贝的了（也就是可能有蛋白表达但量很低了）。当然，我后来没有作进一步的验证，比如做个杂交确证以下拷贝数到底多少，只是一种猜测。
那么，如何提高重组酵母菌的拷贝数呢？对于较早的PAO815质粒，采用的多是体外重组的方法达到高拷贝后再转化；对于pPICZ系列和pPIC9k等等则分别采用Zeocin和G418抗生素筛选的方法筛选高拷贝的质粒；园子里还讨论过一种多重转化获得高拷贝重组菌的方法也值得一试（如下）：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/870484_0.html')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=870387&sty=1&tpg=1&age=0')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/871140_0.html')
欢迎大家讨论！
hustwb (2013-12-07 22:24:25)
楼主，真好心！
我现在在做一个来源于鸡的目的基因的原核表达，用的是pQE30载体，M15表达菌株，SDS-PAGE检测未见表达，我的目的基因是人工合成的，我对它进行了稀有密码子改造，请帮我分析不表达的原因可否？
ero11 (2013-12-07 22:24:43)
相关疾病：
乙型肝炎
我也发表几句。
我是做酵母表达的，算是比较成功的，已载SCI上发表了文章。
毕赤酵母表达系统是应用最为广泛的酵母表达系统，近年来发展非常迅速，目前已利用此系统表达了一系列有重要生物学活性的蛋自质，如破伤风毒素片段C、肠激酶、乙肝表面抗原、肿瘤坏死因子、表皮生长因子等。其主要的优点有：1. 具有醇氧化酶AOX1基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一；2.外源基因整合在酵母基因组上，可以稳定存在；3.高效分泌表达质粒能将外源蛋白表达后，进行翻译后加工处理，将外源蛋白分泌到细胞外，不但提高表达蛋白的活性，而且有利于产物的纯化；4. 菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高，适于大规模工业生产。
我的感觉是，如果想表达高度活性、高产量的真核来源的蛋白时，首选酵母，尤其你想工业化生产的时候，酵母更是第一选择。
windy+++ (2013-12-07 22:25:17)
感谢有人来讨论了，欢迎欢迎！
你说的载体和宿主我都没有用过，只能大致分析，异源表达本身影响因素太多了，但是个人认为最根本的还是要表达的目的片断本身的特点，你既然已作了密码子改造，仍然没有表达，不知是否分析过mRNA结构的问题。
我不太清楚这种体系的特点，有没有可能也是找找看在那个水平开始表达中断了？或者就干脆换体系，一般原核的体系周期应该还是比较短的（当然也有长的，不知你这怎样，也介绍一下吧），换一个还来得及吧。
windy+++ (2013-12-07 22:25:44)
还有希望做其它表达体系的战友也能够参与到本讨论中来，介绍一下你所用的表达体系的特点，以及遇到的一些有代表性的问题及你认为可能的解决方案等等（个人认为即使没有做过的，道听途说也没有关系，只要注明，由战友自己判断可行性即可）。
帖子置顶不容易，不好意思辜负版主大人的一番好意，希望大家支持讨论！
jiushikeshui371 (2013-12-07 22:26:17)
我是做哺乳动物细胞表达的，目前做过几个细胞株的真核表达，也成功的表达了5个蛋白，其中以抗体居多。
其实正如楼上的楼上讲的，哺乳动物细胞表达同酵母表达相比，其最大的劣势在于成本和规模放大。首先，哺乳动物细胞表达时高表达细胞株的筛选是一个相当费时费力费钱的过程，由于外源基因整合位置的不同，导致不同克隆之间的表达差异相当巨大，因此建立一套完善的筛选体系是关键。第二点就是放大成本太大，细胞培养放大非常困难，成本相当高，其关键技术如培养基和流加工艺的控制，目前掌握好这些技术的人在国内屈指可数。
但从另外一个方面讲，哺乳动物细胞表达的优势也是巨大的，首先用哺乳动物细胞表达人源蛋白，由于本身同源性相当强，因此，几乎不用怎么考虑蛋白活性的问题，而这一问题，恰恰是原核和酵母最为头痛的。因此在开发新药上，比其它系统用有无可比拟的优越性。另外，目前，随着哺乳动物细胞表达载体构建的进一步发展，随着细胞培养技术的提升，哺乳动物细胞表达的瓶颈也拓宽了很多，虽然仍然制约着它的进一步发展。
将了这么多，其实我想表明以下观点，哺乳动物细胞表达应该是未来发展的方向和重点，但就目前阶段而言，对不同的蛋白，应选择最适合的表达系统。
以上愚见，抛砖引玉，希望能得到更多的讨论。
yapuyapu (2013-12-07 22:26:36)
不说大道理了，理论的东西网上到处都是，就谈一下自身的经历。
我开始用pPICZaA和X－33表达一个7kd的小分子蛋白，由于没有电转仪，就用氯化锂转化，获得了几十个克隆，但pcr只扩出10个左右。我用的是溶壁酶，和普通的taq酶扩增的，感觉条带很弱；后来改用高灵敏的taq酶，条带果然亮的多，所以我认为酵母壁很厚，做菌落pcr时一定要用高灵敏taq酶。
获得10个阳性转化子后开始了我漫长的筛选过程，我总认为10个转化子，我通过优化条件总能获得1个有表达的吧，即使只有一点点的表达也可以毕业了。但我就是那么倒霉，我把所有能优化的条件全部都优化了，包括ph，温度，甲醇浓度，培养基的成分；所有的检测手段，tricine sds page，wb，dot blot，elisa，甚至活性。每个条件我都重复3次以上，折腾了半年啊。人差点疯掉，愣是没出来结果。
就在准备辍学时（呵呵），发现了pGAPZaA载体，该载体含有新型组成性启动子，无需添加甲醇诱导。从丁香园战友处得到后重复实验，后来简直是顺利的一塌糊涂。呵呵，这方面的情况下次再聊把。
windy+++ (2013-12-07 22:27:06)
QUOTE:
目前哺乳动物细胞表达外源蛋白，确实优势明显、劣势也明显。不过我听说一种“细胞发酵”的方法，就是培养哺乳动物细胞（比如CHO），训练其悬浮生长，培养起来类似“发酵”，也有能达到500mg/L的表达水平，相当厉害。不知有没有做这方面的战友，能向大家介绍一下。windy+++ (2013-12-07 22:27:23)
QUOTE:
看来你的实验跟后来的这种载体pGAPZaA有很密切的关系了？有没有该载体的说明书？向大家介绍一下其特点吧。还有就是我认为你的成功也是与你的努力和经验的积累分不开的，再次祝贺！jiushikeshui371 (2013-12-07 22:27:49)
不过，酵母表达我没有实际做过，最近在看这方面的资料，以后还请两位多多指教，呵呵
uaubc (2013-12-07 22:28:15)
还有真核表达时，293和CHO各有什么优势？
jiushikeshui371 (2013-12-07 22:28:51)
293和CHO各有什么优势，这个问题不好说，因为自己感觉做的还不够深入。简单讲一下感受吧：
293的最大优势在于瞬时表达高，转染效率高。基于这两点，因此，在基础研究和开发新药，或者评价表达载体效果是都非常有用。如果不考虑开发新产品，可以于GFP蛋白联用，绝对是研究新蛋白的非常有效的工具。
CHO的优势在于其悬浮培养后，较293能得到更好的控制，较容易放大到大规模。另外一个巨大优势，是CHO可以贴壁，可以悬浮，而且贴壁时非常容易进行细胞筛选，这是293最欠缺的。另外一个巨大的优势，是CHO－dhfr-的应用，在dhfr－MTX筛选扩增机制下，能得到非常高的表达量，因此很适合工业化应用。
以上是我的一些感受，不知道uaubc是从事哪方面研究的，不妨将您的经验与大家分享一下
yapuyapu (2013-12-07 22:29:42)
==================================================================================
我来介绍一下酵母载体pGAPZaA，该载体为INVITROGEN新近开发的组成性表达载体，其主要特点如下：
1。含有组成性启动子GAP，该启动子为1992年开发的。
2。外源蛋白表达时无需添加甲醇，可以减少污染。
3。表达时使用便宜的YPD，不必使用酵母氮源。
4。含有a－因子信号肽，ZEOCIN抗性基因。
本人认为，第2，3点是其最重要优点，也是我选择它的原因，下面是它的PROTOCOL
yapuyapu (2013-12-07 22:30:05)
电击伤
pGAPZaA的protocol我放在cuturl('http://mail.56.com')里面了，大家可以下载看
下载方法：
1.先注册56邮箱，可以访问下列地址： cuturl('http://mail.56.com')
2.点击“共享资源”，输入sunyong_97,可以看到了。
ritou1985 (2013-12-07 22:30:29)
【讨论帖】有关异源表达的讨论