【讨论帖】蛋白复性

最新回复

• NBA (2013-8-03 17:06:02)

  8M尿素冻结析出的照片，

  
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• NBA (2013-8-03 17:06:38)

  低温，安静，平滑的变性盐下降，加上电场约束，复性还需要什么？希望大家提供宝贵意见，进一步改进这台仪器。

  
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• NBA (2013-8-03 17:07:02)

  电泳图，可能是浓度问题吧！标准BSA跑的有点慢

  
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• NBA (2013-8-03 17:07:26)

  这个设备下游设想再直接连接色谱柱在相对低温下（猜想柱料在低温下应该结合能力更强大一些）进行纯化甚至是进一步复性，不过目前还真没这个能力做。迫切希望大家给提各种意见！非常感谢！

• NBA (2013-8-03 17:08:36)

  
  自己帖，自己顶！很无奈哦！不过谈点对复性的理解：人类的各种工具目前看来肯定的说是无法进入分子内部去调整原子的空间位置，所以留给我们的想象空间不过是创造复性最合适的环境而已。从热力学角度上说，低温状态下更适合蛋白的天然构像。而天然构像的所有信息都是存在于蛋白的一级结构中的。变性剂不过是个中介而已，高浓度时让肽链舒展，浓度逐渐降低时，一级结构里面存在的折叠信息（促进正确折叠的决定因素）逐渐指导分子正确折叠。这个过程中分子之间的缠绕是最大的阻碍。色谱不过是用柱料吸附阻止缠绕而已…………
  还是希望战友们不吝提供各种意见！！至少别让这个帖子沉了！！
  非常感谢！！

• fei1226com (2013-8-03 17:09:04)

  本来认为冷冻复性是我发现的呢！没想到和清华的刘教授交流之后，据他说有国内外有几个小组都做过这方面的研究。我在ncbi上没有查到这方面的文献，不知道是什么原因。
  
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  记得以前我的导师说过一句话，当年我也是有一个自己很得意的想法（关于一种有机合成实验副产物的回收），也是没有见过文献报道。他当时奉劝我不要耗费太多精力，他说：其实聪明人很多，一般你能想到的肯定也会有别人想到，但是为什么没有文献报道呢？原因只有两种可能：1.这么做成本太高，虽然路线通了，但是没有实际操作价值，尽限理论研究而已；2.难度太大，试过的人也就退缩没有下文了。楼主的思路估计属于后者。
  
  不是给楼主泼冷水，而是希望楼主能坚持下去。我们肯定会一直关注的

• NBA (2013-8-03 17:09:37)

  记得以前我的导师说过一句话，当年我也是有一个自己很得意的想法（关于一种有机合成实验副产物的回收），也是没有见过文献报道。他当时奉劝我不要耗费太多精力，他说：其实聪明人很多，一般你能想到的肯定也会有别人想到，但是为什么没有文献报道呢？原因只有两种可能：1.这么做成本太高，虽然路线通了，但是没有实际操作价值，尽限理论研究而已；2.难度太大，试过的人也就退缩没有下文了。楼主的思路估计属于后者。
  
  不是给楼主泼冷水，而是希望楼主能坚持下去。我们肯定会一直关注的
  
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  我做成功过的，没有什么难度呀！还好有人顶贴了！谢谢！
  不过恕我抬杠，难道搞科研的总要跟在别人屁股后面跑吗？天下人都比我们聪明吗？？

• NBA (2013-8-03 17:10:34)

  
  我的导师直后悔自己退休了，他要资助研发，我实在不好意思动用恩师的钱才在这里找合作的。从另外一个角度我给战友们提个观点吧！我们的师长辈多半来自窘迫的研发环境，对钱看的比灵感高的多，没有十拿九稳的把握不会动手的，所以跟随的意念深重。科研求稳很合理，不过也该有前行的意识。此一时，彼一时吧！举个例子，PCR不过就是3个水浴锅做的实验吗？很多情况下科技就是一张挡在眼前的纸！！

• 7437654 (2013-8-03 17:11:32)

  嗯，支持楼主！
  要是搞成功作出产品的话，肯定热卖！！！
  不过我有一个问题，不知道你说的电场是怎么回事，
  要是在蛋白溶液里加电场的话，你的缓冲液pH不能与等电点相同，不然蛋白很可能会沉淀的。但若不为等电点，蛋白肯定会带电荷，这样不就与电泳像似了吗？蛋白会向某一电极聚集，使局部浓度增加，会不会增加分子间的缠绕呢？
  
  请指教，谢谢

• NBA (2013-8-03 17:11:58)

  QUOTE:

  原帖由 7437654 于 2013-8-3 17:11 发表
  嗯，支持楼主！
  要是搞成功作出产品的话，肯定热卖！！！
  不过我有一个问题，不知道你说的电场是怎么回事，
  要是在蛋白溶液里加电场的话，你的缓冲液pH不能与等电点相同，不然蛋白很可能会沉淀的。但若不为等电点，蛋白肯定会带电荷，这样不 ...

  溶液内局部浓度过高的问题也考虑了，分子之间不会无限接近的，毕竟还会有些斥力在起作用。等电点是个问题，目前我的实验是故意忽略这个问题的，就是8.2的溶液，so far,so good. 以后做产品的话肯定得细抠。现在在里面加上了甘油使溶液粘滞一些，何况仅只是加上了一个电场，并没有实际的电流通过溶液，所以考虑忽略电泳还应该是合理的。实在不行就定时翻转一下电场方向就是了。这样回答您能否满意！！
  而且一定频率脉冲的电场估计还有一个好处，就是能破坏那些较弱的错误分子内作用力，就像工地上用振荡器振水泥一样的感觉。不过这纯属猜想！

• NBA (2013-8-03 17:12:34)

  
  刚才没完全理解，抱歉！试管是放在电场里面的，塑料不会阻挡电场穿过。

• NBA (2013-8-03 17:12:54)

  对于等电点还有一个思索，在高压电场存在的情况下，肽链的带电情况应该是不同于通常情况。由于两端电荷在结构上具有的优先性，其整体外形应该趋向一个长条状。当然，随着尿素浓度下降，电场的人为波动，其内在的折叠因素会逐渐起主导作用的。再者，等电点时蛋白变得较不稳定，能达到正确折叠的目的，这点不稳定也不得不接受了。

• ha111 (2013-8-03 17:13:54)

  这个设备下游设想再直接连接色谱柱在相对低温下（猜想柱料在低温下应该结合能力更强大一些）进行纯化甚至是进一步复性，不过目前还真没这个能力做。迫切希望大家给提各种意见！非常感谢！
  
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  直接上柱应该不太可行。一是低温一般结合都会偏弱；二是复性后浓度能有多高呢？上柱样品浓度偏低则生产效率就不行了。
  
  还是做一步浓缩透析在上柱的好。

• NBA (2013-8-03 17:14:29)

  直接上柱应该不太可行。一是低温一般结合都会偏弱；二是复性后浓度能有多高呢？上柱样品浓度偏低则生产效率就不行了。
  
  还是做一步浓缩透析在上柱的好。
  
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  这里我说的柱子可能就与我们通常用于复性的柱子不同了，设想是硅藻土之类的非特异吸附柱，当然离子交换柱也许是可选的范畴。我以前做分子，做DNA回收对我有些影响。那个就是高盐酸性环境吸附，高温TE或水洗脱。用这种方法复性，本身就可以采用高浓度复性，我现在就是2mg/ml的BSA。复性过程由于结晶，蛋白实际上是浓缩的。话说回来，即便这种方式不能彻底复性，我想作为柱上复性的前导过程也应该是有相当价值的。

• NBA (2013-8-03 17:14:54)

  
  目前比较粗的实验能把尿素浓度降低到4M以下。不过设备和条件目前还很粗。更多的就没法提供了！非常感谢各位的意见！

• tuuu2 (2013-8-03 17:15:28)

  首先，在理论上来说，这个设备可行，后期前景可能也比较光亮；
  
  但是，有几点我需要提醒您：
  
  第一、你并没有表达清楚您的意思：
  比如您想寻求哪方面的合作？资金？场地？研发人员？……
  其次合作之后的前期制作、中期研发、后期销售等等细节问题都没有说清楚；
  
  第二、你对自己的产品给出的信息太少了；
  
  只是给出了一张尿素结晶的照片以及一张非常不清楚的图片和一些纯理论的东西。上述资料并不能支持你的产品。在这个时候你需要自己宣传你的产品，比如给出复性与非复性之间的区别等等。这样有意向与你合作的人才会对该产品有信心，否则不要说你的导师，任何人都不会拿钱放在这个自己一点都不了解的东西上面。
  
  说的仔细一点，specific一点，看看我能不能帮上忙～～～

• NBA (2013-8-03 17:15:56)

  QUOTE:

  原帖由 tuuu2 于 2013-8-3 17:15 发表
  首先，在理论上来说，这个设备可行，后期前景可能也比较光亮；
  
  但是，有几点我需要提醒您：
  
  第一、你并没有表达清楚您的意思：
  比如您想寻求哪方面的合作？资金？场地？研发人员？……
  其次合作之后的前期制作、中期研发、后期销售等等细 ...

  
  再提供一个理论信息来支持我的设想，查到DMSO能有效降低冰点到－40度以下。我们冻存过细胞吧！液氮是－196度，所以从这个角度上说，只要有合适的保护防冻剂就可以把冷冻对蛋白的损伤控制在可以接受的范围内，剩下的就是冷冻结晶尿素的问题了。

• NBA (2013-8-03 17:17:24)

  这个设备不过是个敲门砖而已，后面细菌生产蛋白的市场才是真正的主客。1g EGF的市场价格目前是30万。而1升高密度细菌可以产生8g左右的蛋白。说复性是“瓶颈”绝对贴切！谁突破这个瓶颈谁就能“握住明天的第一抹晨曦”！

• NBA (2013-8-03 17:17:47)

  
  原贴是专利申请说明书，是设计的基本框架。在实施过程中也没什么进化。原理就是这么点，用“压路机碾耗子”也没必要。寻求合作是看合作方所能提供的东西了，公司，研究院所都可以，目前我最需要的就是一个实验室。当然还要给我提供基本的路费和食宿条件（我目前没有收入来源）。
  设备目前装在一台废弃电脑的机箱中，外接一台笔记本电脑。由于经费问题，我们没有订做冷井而是控制一台普通冷柜。温度精度有点差，不过也还能将就。电场是近46000－47000伏的样子（高压没法测，只能由理论推测），可设定占空，可设定电压64档。
  现在蛋白生产在中国做的人还不算多，所以我很理解版主说的“任何人都不会拿钱放在自己一点都不了解的东西上面”…………

• 蒲公英 (2013-8-03 17:19:17)

  原贴是专利申请说明书，是设计的基本框架。在实施过程中也没什么进化。原理就是这么点，用“压路机碾耗子”也没必要。寻求合作是看合作方所能提供的东西了，公司，研究院所都可以，目前我最需要的就是一个实验室。当然还要给我提供基本的路费和食宿条件（我目前没有收入来源）。
  设备目前装在一台废弃电脑的机箱中，外接一台笔记本电脑。由于经费问题，我们没有订做冷井而是控制一台普通冷柜。温度精度有点差，不过也还能将就。电场是近46000－47000伏的样子（高压没法测，只能由理论推测），可设定占空，可设定电压64档。
  现在蛋白生产在中国做的人还不算多，所以我很理解版主说的“任何人都不会拿钱放在自己一点都不了解的东西上面”…………
  
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  ....sorry..lz..i would say...
  if u want sth like "目前我最需要的就是一个实验室。当然还要给我提供基本的路费和食宿条件（我目前没有收入来源）。"
  
  AT LEAST you have to show a bit "real result" as an example.
  Use some protein which cannot be renatured properly under traditional bench techniques such as dialysis and so on, but can be greatly purified using your machine.
  
  Meanwhile, you also need to prove that your method is QUICK, CONVENIENCE, and LOW COST according to other traditional protein purification/generation methods, either academic or commercial.
  
  Reducing 8M Urea to 4M, generating BSA and so on, is a great starting point, but im afraid that's definitely not enough of getting funded by the companies.
  
  keep moving and good luck to you