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【求助】关于毕赤酵母发酵的问题
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最近我在做酵母发酵的问题，GS115，按照invitrogen protocol操作，头一次做，没经验，以下是我遇到的一些问题，恳请大家赐教：
1、我按10％的接种量接种，OD600达到了6，发酵罐培养的20小时，DO到了最低的百分之五十多，然后开始慢慢的往上升；是不是这时是它的对数期啊？invitrogen上说，DO会一下子升到100％，当甘油耗尽时，可到32小时后还只是80％左右，没有升到100％，没做过，不知会不会达到100％；假如能达到，一般达到100％需时间多久？
2、流加甘油，一般加多少量？流加多久？流加完就可以用甲醇诱导吗？
3、发酵过程中会有大量的泡沫产生，要不时加消泡剂，我用的是硅酮，不知大家有没有消泡效果更好的，谢谢！
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最新回复
8princess8 (2013-10-09 10:37:17)
DO是发酵的重要指标，但是随着培养基，发酵罐，种子生长质量等多个因素都有直接的关系，不能完全照搬的；此外，国外的mannual很多时候也不能照搬，很多情况汇报都是如此。特别提示：溶氧电极一定要标定准确，要不然会害死人的!
关于甘油的流加主要是为了大道比较大的细胞生长量，便于后续甲醇诱导时的高表达，具体也是与发酵罐有关的，具体的量化值可能需要摸索一下。
硅酮时比较常用的，应该没问题的
ending (2013-10-09 10:37:37)
种子OD值为6应该没有问题。我们一般在20小时左右培养基中的甘油消耗完，DO迅速上升，最后到100%以上。您有可能是DO电极没有标定好，当然还跟您的发酵底料中的甘油含量有关，Protocol中甘油为4%。一般为15-20ml/hr，每隔1hr做DO SPIKE ，防止甘油积累。甘油补料依据到理想的湿重为止，可以4-6hr，也可以10来小时，经过半个小时以上的饥饿期，可以开始甲醇诱导。
zsxan1990 (2013-10-09 10:38:01)
只要DO在急短的时间内（大概三四分钟吧）急剧上升，一般可判定甘油已经耗尽了，不用非得等到DO100多.
8princess8 (2013-10-09 10:40:03)
谢谢各位战友的指导：
我发酵罐的溶氧电极很准的，我又做了一次，30h后，DO还是没有上升到一百，我的底物甘油的含量是4％，应该和你们的条件不会有太大差别吧，可发酵的时间咋会差这么久啊？
loli (2013-10-09 10:40:31)
手册上说的不一定和我们现实中的情况完全吻合。
发酵之前还是最好阅读一些文献资料。发酵得时候很多情况都是变化，很多时候都需要我们当场要给出解决的方案，所以有一些知识的准备是必要的。
8princess8 (2013-10-09 10:40:50)
这次发酵又不行，上清没有我想要的小肽。
整个发酵过程大概如下：
100ml OD约7接种到1200ml basal salts中；
32h后（DO只有60％左右），流加50％甘油含PTM1约250ml，中间约有两小时DO小于20％，不知这个影响大不大？流加10h左右！
饥饿三小时，开始100％甲醇含PTM1的流加，5ml/h流加5h，再提高到12ml/h流加，整个流加过程中，DO 都很高，有百分之七八十，发酵液没有出现绿色。
我每隔8h取样，检测，没有！
谢谢啦
8princess8 (2013-10-09 10:41:37)
我也查了一些资料，都是怎么优化的啊，还有写的也不是很详细，也不知该怎么做啊，很急啊！麻烦各位了！！
plaa (2013-10-09 10:51:40)
DO SPIKE就是指甘油或甲醇补料过程中停止补料，看DO迅速上升10％所需要的时间，如果小于30秒，一般认为没有积累，如果大于30秒，认为补料太快，要等溶氧上升10％后再开启补料泵。
您发酵时一直在看罐吗？我们是一直在边上值班的。好像32小时甘油消耗的太慢了，文献中也就20来个小时。您说50％甘油含PTM1约250ml什么意思？
您用的是什么表型？MUTS？补料是蠕动泵还是脉冲泵？建议您用蠕动泵补甲醇。诱导过程需要一步一步的来，酵母对高浓度的甲醇还是很敏感的，建议您先用50％甲醇诱导，待PH下降。酵母适应甲醇后，再切换到100％甲醇，一般是每小时增加1ml/h.l的补料速度，不可以太快。从您说的看来，再甲醇诱导过程中酵母已经被甲醇杀死了，因为您的溶氧太高，甲醇会把酵母渍死的。
tangxin_80 (2013-10-09 10:52:01)
就是说流加50％的甘油啊。里面含有PTM1，流加了大概有250ml；我的是Mut＋，GS115,是蠕动泵。
那你的最后最大补料速度是多少啊？
可能是甲醇把我的酵母给杀死了啊，呵呵，加了有点快了！
还有我可不可以甘油流加富集后，离心，重悬于不含甘油的basal salts中，流加甲醇诱导表达，我就是怕甘油没消耗完，会抑制表达，可行吗？
谢谢！还有诱导时溶氧一般控制在多少啊？
plaa (2013-10-09 10:52:22)
MUT+一般饥饿半小时到一小时即可，三小时好象太长了。诱导时溶氧一般控制在20到30之间，我们是通纯氧的。我最后的最大补料速度是11ml/h.L。
您都饥饿3小时了，还会有甘油积累吗？
8princess8 (2013-10-09 10:52:46)
还有我说，甘油流加富集后，离心，重悬于不含甘油的basal salts中，流加甲醇诱导表达，我就是怕甘油没消耗完，会抑制表达，你觉得可行吗？
还有我表达的是小肽，不知你有什么高见，谢谢：）
^_^
plaa (2013-10-09 10:53:11)
甘油流加的速度一般在15-20ml/h.L，通过DO SPIKE 控制甘油不过量，甘油流加后一般饥饿，半小时到一小时，开始甲醇诱导，以1ml/h.L起始，每一小时加1ml/h.L，最后到111ml/h.L为止。
甘油流加富集后，离心，重悬于不含甘油的basal salts中，流加甲醇诱导表达，您这样做没有必要，甘油流加后一般经饥饿期，就会消耗完。
8princess8 (2013-10-09 10:55:56)
glass (2013-10-09 10:56:18)
镜检也是一种很好的辅助手段，酵母生长良好的时候，镜下可见大部分都处于出芽状态，生长不好的时候，几乎都是单一的，且大小不均匀。
上发酵罐，也可以采用BMGY，BMMY培养基做啊！这样子省事多了，不过成本高了许多。还有好像消泡挺费心的。
plaa (2013-10-09 10:56:44)
用BMGY，BMMY时不用加组氨酸，在basal salts中它不能自身合成组氨酸，所以要加组氨酸，是这样的吧，在没有组氨酸的情况下，它是不是一点都不生长啊？
在甲醇诱导时，酵母是不是也是处于出芽状态啊？
你们用BMGY，BMMY培养基做发酵过吗？
能说一下步骤，谢谢^_^
还有硅酮做消泡剂会对表达的蛋白有影响吗？
ending (2013-10-09 10:57:07)
请教wongxh2003站友：我做毕赤酵母（GS115)流加时用的葡萄糖（50％），溶氧上升到60％以上打开蠕动泵流加，待溶氧下降到30％停止流加，如此反复。一般达到湿重150g/l需十小时以上，能否给点建议，缩短葡萄糖流加时间，尽早进入诱导阶段？
am10 (2013-10-09 10:57:29)
俺也是第一次上罐，可是DO后来一直是5％左右，火死了！
通得不是纯氧，
可能是DO电极没有标定好，我的上罐和摇瓶的产物的表达量相差不多。是不是应该提高很多？
另外，我需要DO 在35％，是不是需要DO在35％附近较好，还是50％以上好？因为可以用搅拌速度来提高DO 的!
但转速太高会起很多泡沫，其剪切力也会杀伤细胞。
大家的搅拌速度最大是多少啊？
8princess8 (2013-10-09 10:57:49)
我最近发酵了一次，感觉还行！
100ml接种到1.5l发酵液种，23h后DO突然上升达到100％，流加50％甘油，8h；饥饿半小时，流加甲醇，DO控制在30％～40％之间，最大转速达到800；用硅酮做为消泡剂，效果很好！
xyw5 (2013-10-09 10:58:17)
100ml接种到1.5l发酵液种，23h后DO突然上升达到100％，流加50％甘油，8h；饥饿半小时，流加甲醇，DO控制在30％～40％之间，最大转速达到800；用硅酮做为消泡剂，效果很好！
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表达量如何？
kswl870 (2013-10-09 10:58:44)
关于罐发酵，种子OD600约6到20是合适的。种子培养基可用YPD或BMGY或BYPD均可。通常从MD平板上刮3~5环菌接到10mlYPD中，在30度，240rpm摇24小时，再转入100~1.2L二级培养基中同样条件摇16小时即可入罐发酵。发酵罐以无机盐为培养基，用氨水调PH5.0，一般葡萄糖或甘油在发酵20小时左右耗尽，此时DO迅速上升到100%，可流加葡萄糖或甘油。我常不加PTM1（只在接种前加4.4ml/L培养基），当湿重达需要值时，饥饿培养30~60分钟，再加甲醇100ml/50L培养基以让菌适应，当DO下降然后上升到100%时即可流加甲醇，与流加葡萄糖一样依DO（这样也不需加纯氧哦）反复流加直到发酵结束。我做EGF、FGF均这样表达挺好的。消泡剂我用南京四新很不错哦。
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