【讨论帖】我在SDS-PAGE中所犯的错误

最新回复

• 2541 (2013-12-12 16:18:13)

  我觉得防止记错加样顺序的方法可以是，MARKER两边加不同个数的样本。如：MARKER左边加了4个，右边加了5个。脱色完了，一看就明白了。

• vcve (2013-12-12 16:18:38)

  
  我对跑PAGE也是深有体会，说出来与大家共享。
  1.我们的AP一般分装后放在－20冰柜中，用时拿出融化，这样使用保存时间很长。
  2.上样时一定同时在实验记录上记下你的上样顺序，因为如果你跑整块胶一定是不同的样，因此，脱色后可以根据记录大致判断出加样顺序。还有，上面的仁兄说得中间偏向空一个孔，两边加不同数量的样也可；再或者记住marker的位置，同样不会弄错左右面。

• ha111 (2013-12-12 16:19:17)

  楼主，你老弟真行，别人遇上一个二个问题也就罢了，你竟然全碰上了，真有你的。呵呵。
  
  SDS-PAGE 所用的溶液一般有效期为一个月左右。但是10%SDS溶液的有效期为一周，且常温保存。如4度保存会结晶。AP的有效期也为一周。
  
  我用的电泳仪是BIO-RAD的电泳仪，灌胶时不用封底。

• mysmdbl (2013-12-12 16:20:05)

  10%SDS溶液我常温存了半年多还是可以用的

• mimili_901 (2013-12-12 16:20:54)

  我们溶液除了AP和temed都在室温放着，时间都在一个月以上（AP，三周以上），以前没有出现任何问题！不过最近靠近上边的带没有跑出来，就是缺带了，可能是时间太久了（有半年了），马上重配，再试试！
  

• zranqi_1 (2013-12-12 16:21:14)

  我和同学做实验时配了1000ml 10%SDS，结果全科人用了一年多将近两年也没见出什么问题，也就是常温放置。

• kuaizige (2013-12-12 16:21:50)

  sds没问题的，但是低浓度ap最好当天使用，半衰期很短

• DONT (2013-12-12 16:22:12)

  sds一般可以常温保存不会失效，但AP最好每次都要新配，如果低温保存一般的保存时间是一周，最好不要超过两周，以免失效，反正我们可以少配。剥胶时我们可以一边撬玻璃板一边用流水冲洗，一会就可以完整的剥下来。

• gogo (2013-12-12 16:22:46)

  我这里AP在－20度放置，temed在4度放置，其他在室温放置，基本上多半年无问题。我的体会是，电泳缓冲液很重要，最好用数次就弃去，还有上槽液和下槽液要分开，用几次后，可以将上槽液改为下槽液，弃去下槽液。当然这是针对Bio－Rad这种上下槽分开的系统。

• glass (2013-12-12 16:25:56)

  我的AP是分装成小管，放－20保存，每次用一管，印象中半年是没问题的。TEMED是放4C。其它常温放置。另外配制顺序最好是TEMED先加，然后再加AP，因为没有TEMED，AP也可以引发聚合反应，只不过速度稍慢一些，对于学过高分子的人这些最清楚。

• kuaizige (2013-12-12 16:26:14)

  请教几个问题：
  1、我的胶凝后总有少量水分析出，是否正常？
  2、按照分子克隆配的12％胶20kDa的蛋白跑不出来，且染料的位置有一条深染的条带，只有15％的胶下面条带才消失，我跑的是细菌总蛋白，是否是因为胶的实际浓度低所致？
  3、细菌沉淀直接加2×buffer，煮沸5分钟变性，离心后上样，是否可行？为什么有的样品稀，有的样品特浓，上样都困难，跑出来后严重脱尾？
  4、哪位高人有蛋白表达方面的经验请指教！

• zhenxin (2013-12-12 16:27:01)

  琼脂粉可以用作封底胶。我们实验室一直在用！物虽不很美，但价廉！

• H2O (2013-12-12 16:27:25)

  我跑12%的胶，没出现过你说的深带。
  我一般是细菌沉淀直接加样品buffer，再加5ul的巯基乙醇，混匀，离心，煮沸10min，直接上样，效果还行

• kuohao17 (2013-12-12 16:28:04)

  1。可用聚丙酰胺快速胶（加大AP和TEMED的浓度）封底；
  2。AP -20C分装保存，可至3个月；
  3。做好分离胶后，要小心地用水封，避免空气影响胶的聚合；
  4。细菌沉淀加1XBuffer，可溶性样品加2XBuffer，煮5min，上样10-20ul；
  5。剥胶用Bio-Rad的剥胶塑料板非常方便，用注射器注水冲的方法易搞破胶。

• 6327555 (2013-12-12 16:28:36)

  琼脂粉可以用作封底胶。我们实验室一直在用！物虽不很美，但价廉！
  
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  你用的琼脂粉是多大浓度的，我用2%都不能好。

• xingyi08 (2013-12-12 16:29:44)

  我用1%的琼脂封胶效果很好，有时候琼脂的质量不同，用的浓度就不同，我们实验室发现即使是同一厂家不同的批次质量都不同，你的琼脂可能质量不好，你可以加大浓度试试。

• ALALA (2013-12-12 16:30:29)

  
  细菌沉淀用1×或2×buffer有什么区别吗？

• utt0989 (2013-12-12 16:30:50)

  胶的配方大家的实验室都应该做过一些修订，能否公布出一些大家觉得效果比较的胶的配方？

• 6327555 (2013-12-12 16:31:21)

  QUOTE:

  原帖由 utt0989 于 2013-12-12 16:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  胶的配方大家的实验室都应该做过一些修订，能否公布出一些大家觉得效果比较的胶的配方？

  我参考的是：汪家镇的＜蛋白质技术手册＞，那本书还是很常用的。

• 6327555 (2013-12-12 16:31:38)

  QUOTE:

  原帖由 kuohao17 于 2013-12-12 16:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  1。可用聚丙酰胺快速胶（加大AP和TEMED的浓度）封底；
  2。AP -20C分装保存，可至3个月；
  3。做好分离胶后，要小心地用水封，避免空气影响胶的聚合；
  4。细菌沉淀加1XBuffer，可溶性样品加2XBuffer，煮5min，上样10-20ul；
  5。剥胶用Bio-Rad的 ...

  TEMED可以加倍，只要在10ul以下，AP可以加二到三倍。