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【求助】Western-Blotting全湿转膜
【求助】Western-Blotting全湿转膜
我用的是amershem公司的Mini电泳槽,做WB用的是全湿法
缓冲液是25 mM Tris, 192 mM 甘氨酸, 20% (v/v)甲醇 (pH 8.3)；
胶大概是8cm x 7.3 cm，厚度0.75mm。
参数：恒流200mA，2 hours。。ＰＶＤＦ膜
我的目的蛋白有四个：160KD； 125KD ； 68KD ；（内参）43KD；
第一次和第二次实验都是在没什么理性认识的情况下做的，属于处女作，转移的挺好的，
后来的几次，直到现在一直转膜不成功（有了实践经验和理论认识了，反而做不出来了），，郁闷啊！！急啊！！
主要问题是： 转移后，膜用立春红染色没发现蛋白（通过他组实验证明立春红没问题），转移后的胶用考染，也没有蛋白，蛋白跑到哪里去了？？
我在怀疑蛋白漏到缓冲液去了，，但是为什么呢？不明白。。
可以肯定的是条件（比如缓冲液，电流，时间）和做成功的前两次没有变化
我想请问可能原因会有哪些？？我的ＰＡＧＥ可以确定也没问题的，转移缓冲液也每次用新的。而且头两次做的时候转移缓冲液用两次都没关系的。。
我自己分析如下，不知当否：
一，我的ＰＶＤＦ膜没处理好，所以胶上的蛋白转是转走了，但没转到膜上？？ 我的ＰＶＤＦ膜处理反复改过几次，记得刚开始时是当开始ＰＡＧＥ时就把ＰＶＤＦ浸泡在甲醇里了，时间很长，后来听别人说泡时间长了不好，而且说明书上说纯甲醇浸泡几秒钟就可以了，然后在缓冲液中平衡，也没说平衡时间，只说平衡至膜在缓冲液中漂起来就可以了。。但是我试了几次，根本就漂不起来啊。。然后请教别人，他们说平衡３０min 的也有，平衡１０min的也有，平衡15min 的也有，到底平衡长了好还是短了好？？是不是这个原因？ＰＶＤＦ膜到底该如何处理？？
第二，膜和胶的大小问题，刚开始那次膜是很大的，两张滤纸比胶大，但是都比膜小，膜可以保证滤纸不短路。。后来为了省膜，改为一样大，没有成功，但是再改回来，也不成功，，到底怎么做才对？？短路指的是什么意思？我发现好多同行都解释不清到底是怎么短路，怎么做才对？我也糊涂了
第三，做的时候，做三名治在电泳夹里做好，还是先做成三名治再放到夹里好？？说明书上是在一个大托盘里盛上缓冲液，把电泳夹放在托盘里，然后海绵滤纸胶滤纸海绵等一层一层做上去的，但是由于缓冲液比较多胶容易漂浮移动，膜也容易漂浮移动，这样做有影响吗？
另外的问题：我们做三名治的专用滤纸没有了，这种滤纸很贵，５０小张就５００多，，听说普通的滤纸就可以，三层效果就好，可以吗？？
转移缓冲液如果用两次的话，第二次加多少甲醇呢？？还和第一次一样加２００ml吗？？
另附上我的protocol,请指教，看看偶的操作有没有问题。。谢谢
提前制冰或冰袋；提前浸泡PVDF膜
1．将电泳缓冲液分倒入一个托盘中一部分，然后将电泳槽夹板，泡末板，滤纸都放入托盘中，夹板的阴极（黑色一半）朝下平放，然后将一块泡末板放在黑色夹板上，用液体浸透赶走气泡，再将滤纸放在泡末板上面，用液体浸透赶走气泡(可用玻棒赶)，再将PAGE凝胶小心铺在滤纸上，用液体浸透赶走气泡，再将膜按照凝胶标记的同处也剪个斜角做标记（为以后好分辨正反面），然后放在缓冲液里，凝胶的上面；用液体浸透赶走气泡，同样的方法再放上滤纸和两层夹板（注意赶气泡，注意阴阳极，凝胶靠阴极，PVDF膜靠阳极）；将夹板的阳极（红色一半）盖上夹紧后插入电泳槽中。
2．电泳槽中的夹板上的电泳液要加满。注意是否漏液。盖好电泳槽盖子；
3．电泳：打开电源，条件：恒流：225m A , 2-2.5小时（最成功一次的转移条件）
4．电泳停止后，将PVDF膜卸下，准备免疫印迹。（为了用于检测，PVDF膜可以先用丽春红染色观察转移效果，也为后面孵育前剪目的蛋白条带提供参考；同时转移后的PAGE凝胶考染检测转移效果）。
还有个版本（最近用的）
转移电泳设备：电泳槽，泡末板，专用滤纸，PVDF膜（提前将PVDF膜剪成8×9cm大小，滤纸剪的和平衡后的PAGE胶（7×8 cm）差不多大小，并剪角做标记（胶切去溴芬蓝外部分，左下剪角标记，膜比胶稍大，滤纸稍小些，并按照胶孔道位置用铅笔在PVDF膜上做标记，有利于下一步剪膜）。
步骤：（切记不要有气泡）
1．将电泳缓冲液分倒入一个托盘中一部分，然后将电泳槽夹板，海绵，滤纸都放入托盘中，夹板的阴极（黑色一半）朝下平放，然后将一块海绵放在黑色夹板上，用液体浸透赶走气泡，再将滤纸放在海绵上面，用液体浸透赶走气泡(可用玻棒赶)，再将PAGE凝胶小心铺在滤纸上（保证一次铺好，不要再移动），用液体浸透赶走气泡(可用玻棒赶)，再将PVDF膜按照与凝胶相同的标记位置（为以后好分辨正反面）放在凝胶的上面（一旦接触胶就不要移动，避免重复移动膜）；用液体浸透赶走气泡，同样的方法再放上滤纸和两层夹板（注意赶气泡，注意阴阳极，凝胶靠阴极，PVDF膜靠阳极）；将夹板的阳极（红色一半）盖上夹紧后插入电泳槽中。红色面向泳槽外。
2．电泳槽中的夹板上的电泳液要加满。注意是否漏液。盖好电泳槽盖子；
3．电泳：打开电源，条件：恒流：225m A , 2.25小时.
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最新回复
bring (2014-6-28 16:42:34)
以上的所有问题,可以归结到一个问题上,就是你的理论还没有到一定的高度!
当你完全理解了WESTERN 的每一步的意义后,任何问题你多能解释,也可以随时改变你的条件,只要是你认为合理的(这要在你理论很结实的情况下)
当胶和膜都没有蛋白的话,如果你能保证你的蛋白在没转膜前是有的,那么一定是你在转膜中出现问题了!
可能情况,你电极有没有搞错,你的胶和膜的顺序对吗!
有没有短路,短路是指电流不通过你的胶和膜的公共部分,而直接通过某个部位!也就是你的胶和膜的公共部分的电流是没有的或只有很小的电流!不能抵制由于热运动的力!
bangqi_k (2014-6-28 16:42:55)
因为我前两次做过是成功的，
蛋白转膜前是有的，因为我用其他实验室的半干转也能转膜成功，我也知道是转移出了问题，
电极不会搞错的，胶和膜的顺序也没错．这些简单原因我已经排除了，谢谢楼上同仁了！！
你所说的短路就是指两张滤纸接触了，对吧？？
仍然郁闷中！！
tangxin_80 (2014-6-28 16:43:16)
考虑一下,如果电极无错,应该是转过了,我跟你做的差不多,歪打正着转成了一次,以后也都不成,而且我的PVDF膜用丽春红染色后,整个膜一片红,洗不干净,也不知道怎么回事.
普通的滤纸可以的,不一定是三层,只要能夹紧就好,没那么教条的.
如果每次转的胶的面积不一样大的话,所用的转移的时间也是不一样的
bangqi_k (2014-6-28 16:43:39)
QUOTE:
也考虑过是转过的原因，但是我把电流降到１５０mA,２小时，仍然不行的啊，还要再降吗？？？我怀疑是漏掉了．．．你遇到过膜 胶都没有的情况吗？？tangxin_80 (2014-6-28 16:45:09)
我自己分析如下，不知当否：
一，我的ＰＶＤＦ膜没处理好。到底平衡长了好还是短了好？？是不是这个原因？ＰＶＤＦ膜到底该如何处理？？
第二，膜和胶的大小问题，刚开始那次膜是很大的，两张滤纸比胶大，但是都比膜小，膜可以保证滤纸不短路。。后来为了省膜，改为一样大，没有成功，但是再改回来，也不成功，，到底怎么做才对？？短路指的是什么意思？
另外的问题：我们做三名治的专用滤纸没有了，这种滤纸很贵，５０小张就５００多，，听说普通的滤纸就可以，三层效果就好，可以吗？？
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1、PVDF膜并需要怎么处理，放在缓冲液里面5min就足够了。关键是你的pvdf膜质量如何？
2、所谓短路，是指三明治的上层和下层的滤纸搭到一起去了。所以每次修剪的时候，把滤纸剪得比胶和PVDF膜都小，防止上下两层的滤纸搭到一起造成短路。
3、如果条件许可，请使用invitrogen的彩色marker，转膜是否成功，只需要看marker就知道了。转膜成功的话，转到pvdf膜上的marker色彩鲜艳，非常漂亮。
4、我的转膜条件：
转膜缓冲液：同上述。能反复使用达5次以上！
注意：电泳时，放在冰上，电泳仪用冰包围住。并观察电路是否通畅。
转膜条件：260mA，恒流100min。
做了好多次，从来没有听说还有转膜转不上的。
祝你顺利！
bangqi_k (2014-6-28 16:45:45)
QUOTE:
1.我用的PVDF膜和去年11月份用的是一批,而且我说了前两次转的效果也不错..所以PVDF膜质量应该没问题,而且最近我让其他实验室用这种膜做过半干转,也没问题,效果很好啊.2.如果是指这个,那短路的问题在我这里是不存在的
3.预染MARKER,我用过,也是前两次转时都可以转过来,可这几次MARKER也转不过来,,哈哈，我要哭了
4.转移电泳加冰降温,我也做到了.哈哈,没用的,,
是的，仁兄,这种情况许多高人都说不可能,但就是在我这里发生了。....哈哈啊
你的转膜条件：260mA，恒流100min。请问你的protein分子量多大???用的是什么电泳仪,和我的一样吗??
one (2014-6-28 16:46:28)
还有一个最笨的方法：让其他同学或其他实验室同学同时帮忙做个平行对照。
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哦,谢谢,那我的蛋白是160KD,而我用的电流是200mA,其实最近我150,200,225,250mA恒流都用过的,都不行,而最初的两次200和225都可以转过来
你们用的是什么牌子的转移装置??我最近发现我的转移槽的三明知很松,转移槽卡不牢了，可能是因为海绵用久了薄了,,和这个有关系吗??
luoliqiong (2014-6-28 16:46:52)
我们转移的protein从15KD到65KD，都没有问题。
还有一个最笨的方法：让其他同学或其他实验室同学同时帮忙做个平行对照。
我们的装置是biorad的，呵呵。
bangqi_k (2014-6-28 16:47:13)
一面红,一面黑的那中迷你电泳装置,对吗??
那我的160KD,你建议条件是什么,电流是否应该加大??还是说200MA可以适用大部分蛋白???
bangqi_k (2014-6-28 16:47:35)
yjf1026 (2014-6-28 16:47:56)
我曾经做过130－230KD的转膜，用60mA转膜过夜（10小时－15小时左右），用BioRad的小槽，转印的膜为一整张PAGE胶那么大，效果比较好。
你如果认为是夹板松了可以将滤纸加厚一点。
如果怀疑是转印时间太长，你可以在正极加上两层PVDF膜。
你要看看你的转印缓冲液前后两次是否一样，新的缓冲液转印效率要比旧的高不少。
bangqi_k (2014-6-28 16:48:15)
问题:
1.转移缓冲液用前要加甲醇,新配的没问题,照要求加就行了，我一般加到20%(1000ml中加200ml甲醇,),但是缓冲液第二次用时又不知道甲醇挥发了多少,用前加多少甲醇??还加200ml吗??
2.PVDF膜我浸泡在甲醇中2个小时,没问题吧.??
qhyu (2014-6-28 16:48:45)
那我的160KD,你建议条件是什么,电流是否应该加大??还是说200MA可以适用大部分蛋白???
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一面红,一面黑的那中迷你电泳装置，对啊。
至于多大分子量用多大电流，我没有实际经验，所以不能误导你。具体要靠实践来摸索。
PVDF膜我在冰浴的电转液里放了5min左右，呵呵。
wmp1234 (2014-6-28 16:49:53)
我们实验室的做法是转膜前用甲醇先泡膜15min，在用回收的的转膜缓冲液浸泡30min, 然后用新配的转膜缓冲液转膜 ，恒压100v，时间60min，每次都能转上
zhenxin (2014-6-28 16:50:09)
在这里提醒一下，PVDF膜质量有没有问题？我曾碰到过这样的情况，膜不知道何时购买的，导致实验失败，换了膜马上成功。
至于甲醇浸泡时间，我是5秒，再用水洗，然后用缓冲液泡，时间没有定论。
短路问题我也没有碰到过，不管是三名治任何一个大都没有关系。要真担心这个，可以让膜最大，那就万无一失了。
电流一般可以按面积来算，2mA/cm2。时间2-3h。
有预染Marker最好了，跑电泳时，可以以Marker为对称，跑两份样品，一份染色，一份电转，这样就可以排除电泳的问题了。
remenb (2014-6-28 16:50:26)
缩短时间就可以了,干吗要调电流,这个我们有感觉不来的
我转膜的条件是:稳压40V,转1小时20分钟,结果,只转上了低分子的,还能搞.
我的标准蛋白的分子量在53KDA----220KDA之间.
98776langtao (2014-6-28 16:50:46)
首先，你要确定膜没有问题，又没有污染。比如：你在处理PVDF膜的时候前往不能用手直接摸，手上有油脂。会影响蛋白与膜的结合。不信你可以剪一小块用手试一下 ，你能明显看出，手摸过的地方与周边不一样。
当然你是不会这么做的，但是你最好检查一下膜。是不是已经污染了。
我跑过200KD的蛋白，用的条件是恒压110V，时间是3小时。你的160KD可以缩短点时间。
还有就是PVDF末的浸泡，我一般都是在取胶的时候，把膜放进转膜缓冲液，然后等胶弄好了，就拿出来。时间也就3~5分钟吧。
nut6694 (2014-6-28 16:55:16)
楼主现在做出来没有呀，到底是哪个地方出问题呀，我现在也遇到了这个问题，我染胶发现很好，转膜什么都没有，把剩下的胶染后也没有残留，我也不知道什么原因，你最后找到原因了吗，多加两块海绵或者滤纸能不能解决问题呀
6327555 (2014-6-28 16:56:08)
我关于蛋白转膜的一点体会,转膜夹一定要加紧,PVDF膜甲醇处理30秒足够了,用双蒸水洗涤2分钟后,放于转膜液中,保证PVDF膜变透明,甲醇你可以用10%的,我跑过大分子量的蛋白,结果还好,转膜条件400ma,90min-120min足够了,国产普通滤纸两层就可以了,转膜后要晾干PVDF膜,切记不能太干,否则蛋白会丢失.
caihong (2014-6-28 16:56:28)
第一 不知道你的胶浓度时多大，要是小的话是可以跑出去的，转膜液就当然没有用了
第二 转膜前transfer-buffer 最好是在4摄氏度先冷却一下，这样有利于转膜
第三 你的转膜时间是不是要试着去摸索一下，设个时间梯度会好点
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