【求助】求ＥＣＬ高手解决ＷＢ显色问题

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-3-23 23:38 作者: ns5fan 来源: 分析测试百科网

昨天做了个２Ｄ的ＷＢ，转印后用立春红染色发现蛋白已全部转上，ＴＢＳ５％脱脂奶封闭过夜，一抗兔血清用ＴＢＳ加５％脱脂奶再加０.０５％吐温１：３００稀释孵育４小时，TBS加０.０５％吐温洗５次，每次１０分钟，２抗羊抗兔ＩＧg，用ＴＢＳ加５％脱脂奶再加０.０５％吐温１：２００００稀释孵育１小时，TBS加０.０５％吐温洗５次，每次１０分钟，用皮尔斯的ＥＣＬＡ，Ｂ液各２ml混合滴加在ＰＶＤＦ膜上，把剩液控掉，用保鲜膜包住，此过程中可能有液残留在膜上没弄干净，因为ＰＶＤＦ膜过大（１８＊１８cm）可能有保鲜膜褶皱，在暗室中压片，在红色安全灯下看到了有三个蛋白点发出的黄色荧光，第一张片压了２０s，第二张压了１分钟，结果在看不到荧光的地方却显影乌黑一片，发荧光的地方却没有显影，很象印象派的艺术作品，很是纳闷，第一次做ＥＣＬ，因为样品很珍贵不能天天重复实验，请各位高手门鼎立相助，小弟这里先谢谢了．．．．．．

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【求助】求ＥＣＬ高手解决ＷＢ显色问题

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最新回复

duoduo (2014-3-23 23:38:52)

呵呵，仔细看了一下，就发现一个问题，一抗的浓度太高了，如果检测的是重组蛋白的话1：300太高了。其他没发现问题。
ns5fan (2014-3-23 23:39:12)

一抗是那种直接从兔子里面取的血清啊,不是单抗也不是多抗,效率很低的,1:300高么?楼上的意思是说因为一抗浓度太高了,没洗干净导致二抗结合发光液再结合结果全部都显色的么?
白白的 (2014-3-23 23:39:30)

血清1：300也有点高吧？要不做个梯度试试？说实话，曝片子我没什么经验，但ECL法为什么不用个成像仪呢？就算自己实验室没有，哪还没有个成像仪吗？再者，二抗有那么牛吗？1：20000都可以？我觉得一般1：3000就差不多了吧？严重怀疑曝片子过程有问题，既然暗室都能看见三个亮点，怎么会曝成这样呢？
ns5fan (2014-3-23 23:39:51)

汗－　－！还真没成像仪，二抗是进口纯化过的ＨＲＰ标记的ＩＧg，实验室其他人１：２００００用ＤＡＢ显色都出来了，应该不是二抗的问题，纳闷的是为什么黄色荧光显不出来，没有荧光的地方出来了一堆黑东西．．．．．．．
duoduo (2014-3-23 23:40:10)

那一抗到底是什么呢？
别想了，重新来一遍看看
youyou99 (2014-3-23 23:41:08)

哈哈
看来是你包膜的保鲜膜中液体漏了出来或显影盒中有水
防侧漏
很重要
eric930 (2014-3-23 23:41:36)

QUOTE:
原帖由 youyou99 于 2014-3-23 23:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
哈哈
看来是你包膜的保鲜膜中液体漏了出来或显影盒中有水
防侧漏
很重要
我也觉得这个的可能性大，因为这个影像成液体状。注意在显影之前一定把膜弄干（一般用滤纸夹一会，或者两张滤纸一张夹过再换一张就可以进暗室了）。加完ECL之后看见荧光立即贴在事先准备好的保鲜膜上，然后尽快将保鲜膜对折贴住PVDF（或NC）膜上面，压片，没有问题。再做一次看看，一次结果不能说明问题，而且这个显然不是典型的问题，应该属于偶然现象，如果老是这样就得看看是不是电泳或者抗体的问题了。
强烈建议先做一个点杂交，很好做的，主要看看抗体以及其后的显影这个系统有无问题，半天完事。欢迎你及时反馈最新的实验结果，以便进一步讨论。
#问号# (2014-3-23 23:42:18)

我也怀疑主要是这个问题,下周再做个试试,奇怪的是液体漏了出来不发荧光也会显色?
ffaa (2014-3-23 23:42:36)

这里有很多ECL介绍,也许对你有用.
cuturl('http://www.cnbiotech.com/html/protein/20070805/2260.html')
XYZQ (2014-3-23 23:43:07)

一抗是那种直接从兔子里面取的血清啊,不是单抗也不是多抗,效率很低的,1:300高么?楼上的意思是说因为一抗浓度太高了,没洗干净导致二抗结合发光液再结合结果全部都显色的么?

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我们检测重组蛋白的话，一般血清都是1：10000-1：20000的
1：300做天然的还差不多，重组一定过高了
taoshengyijiu (2014-3-23 23:43:24)

个人建议从以下几点注意：
1. 一抗是否能再稀释一些，1：300可能会有点高，你试试1：500，或者1：700。一抗时间缩短为2h会不会更好呢？
2. 二抗既然别人试过了，可能就不用改了。
3. 最后一遍洗完了，要尽量去除表面的PBST，我是把PVDF非结合蛋白的一面向下放在吸水纸上，然后用镊子拎起来立在纸上，尽可能去除PBST，但不能完全干。
4. ECL混合液你作用了多久？是否按说明书操作？一般3-5分钟，也许每家不同。
5. ECL混合液作用完了，也按照第3步尽可能去除液体。我感觉你的图像很像发光液汪在PVDF膜表面。
6. 还有，安全灯是否安全？
7. 祝大家好运，我第一次做ECL，让整个实验室笑了2周，实在是汗颜……
birdfish (2014-3-23 23:43:42)

相关疾病：
白癜风
在暗室里能看见荧光的地方肯定能显出来，就是因为压片时间太长了，过度曝光反而会造成白斑的，可以就压几秒钟试试Smile
ns5fan (2014-3-23 23:45:01)

5. ECL混合液作用完了，也按照第3步尽可能去除液体。我感觉你的图像很像发光液汪在PVDF膜表面。

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谢谢各位热心战友提出的宝贵意见,今天又重复了实验,把PVDF膜上的发光液除干净了,结果就出来了,那些肠子都不见了,蛋白点也很清晰了,原来还真不知道发光液也能显影.....
我的问题已经得到了很好的解决,谢谢各位提出的宝贵意见Smile
birdfish (2014-3-23 23:45:32)

QUOTE:
原帖由 ns5fan 于 2014-3-23 23:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
5. ECL混合液作用完了，也按照第3步尽可能去除液体。我感觉你的图像很像发光液汪在PVDF膜表面。

=============================================================================================================== ...
发光液＝鲁米诺（发光氨）+双氧水，在有氧化剂的地方都能发荧光。
CSI中不是用这个来检测血迹嘛
wawa (2014-3-23 23:46:20)

我也发个我以前做的2DE+WB怪图(曾经发过)

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