【求助】第一次跑的Ag染

最新回复

• avi317 (2014-6-08 11:24:28)

  
  1.聚焦时间不够引起的，因为你17cm胶条10000v只聚焦到40000vhs，显然不够，应该在80000vhs左右。
  2.可以在1000v-10000v之间再加两个梯度，这样效果会好些，
  3.根据你的样品定量确定上样量，一般银染130ug左右，从图上看上样量还可以。

• junhun (2014-6-08 11:25:01)

  谢谢楼上的朋友
  1.对于聚焦时间,我做实验前,打电话向Bio-Rad公司的负责蛋白质组学市场的技术员咨询了一下,我本来聚焦时间是通用的推荐的60000Vhs,但他说这个很容易造成DTT的消耗,他说40000Vhs就够了,就改用了40000Vhs了;做完最后染色后,我专门叫他过来看了一下gel和扫描后的imagel,他的建议是把聚焦电压从10000V改为8000V,仍然40000Vhs.
  2.1000V-10000V之间的梯度如何设置?slow,linear or rapid ?
  3.Ag染时专门请了2-DE高手来监督,她说这个显色时,点出现的太快了,估计是量真的太多了(本来是想使用Blue Silver G-250 CBB染的)
  不知道各位2-DE师兄师傅还有什么建议吗?

• avi317 (2014-6-08 11:25:26)

  
  1. 8000v和10000v差别不大，主要是聚焦程度，40000vhs可能对一些样品来说足够了，但对你的样品不够，一般聚焦不能低于60000vhs。DTT的还原效果较强，基本上你混合进去没多长时间就还原结束了，无所谓消耗。
  2.可以加2000v，linear;5000v，rapid;
  3.点出的快慢和上样量关系不大，正常情况银染是所有点一起显现；上样量过大的话，显色会出现一团一团的，轮廓模糊，而且会影响低丰度蛋白的分离，从你的胶上看，上样量影响不是很大，这和你的蛋白浓度有关。

• junhun (2014-6-08 11:25:53)

  
  3X a lot!

• 8princess8 (2014-6-08 11:26:24)

  QUOTE:

  原帖由 junhun 于 2014-6-8 11:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  第一次跑的Ag染,条件:Clean-Up后上样量220ug,17cm pH3-10胶条
  IEF条件:主动水化50V 15h;S1,250V线性30min;S2,1000V快速1h;S3,10000V线性5h;S4,10000V快速40000V.H;S5,500V保持.
  SDS-PAGE:加低熔点Agarose时溶化不充 ...

  你好：
  我想问下银染你是用什么容器染的阿，大胶没有合适的使用与做银染的容器阿

• junhun (2014-6-08 11:26:59)

  我们用从隔壁实验室借来的定做的玻璃缸．我们实验室起步不久，容器染缸已经订做了一批，是23.2cm*23.2cm*5cm的有机玻璃,80元/只,下周四就可以到了.请问,有机玻璃和一般玻璃都适用于Ag染吗?

• 8princess8 (2014-6-08 11:27:52)

  我们用从隔壁实验室借来的定做的玻璃缸．我们实验室起步不久，容器染缸已经订做了一批，是23.2cm*23.2cm*5cm的有机玻璃,80元/只,下周四就可以到了.请问,有机玻璃和一般玻璃都适用于Ag染吗?

• taoshengyijiu (2014-6-08 11:28:17)

  我们染色是在超市买的抽屉式的文件柜，很好用。

• junhun (2014-6-08 11:28:45)

  
  但是文件柜在加工的时候好象都有一个圆盘状的突出呀，会不会在摇床上时会不会把胶给弄破烂呢?

• 3648755 (2014-6-08 11:32:41)

  
  麻烦您可以不可以给一个银染的protocol?
  谢谢！

• orangecake (2014-6-08 11:33:04)

  请问你的材料是什么?样品处理方法是什么?第一次做就做的怎么好,很值得羡慕了!我作了快半年了,就是不好,请赐教!谢谢!

• junhun (2014-6-08 11:33:33)

  
  Ag染为快速Ag新染法:
  1)固定:5%乙酸+50%EtOH 20min;
  2)敏化:300ml EtOH,3.2gNa2S2O3.5H2O,11.25gNaAc.3H2O(或6.784g无水NaAc),用MilliQ水定容到1000ml 30min;
  3)水洗:5min×3
  4)Ag染:2.5gAgNO3用水定容1000ml 20min(中间可换几次AgNO3溶液);
  5)水洗:1min×2
  6)显色:25gNa2CO3,400ul甲醛(可适当增加用量)用水定容到1000ml.需立即用显色液淌洗一下，再换新鲜显色液再显影;
  7)终止:14.6gEDTA定容到1000ml(需提前配置,较难溶)

• junhun (2014-6-08 11:33:54)

  
  我的材料为U251细胞株,处理是7M urea,2M thiourea,4% CHAPS,65mM DTT,0.2% Bio-lyte 3/10,裂解10min后,超声处理约1min,离心取上清,定量,Clean-Up,再定量,再离心,上样,IEF,平衡,SDS-PAGE

• orangecake (2014-6-08 11:34:12)

  多谢！你没有加蛋白酶抑制剂和核酸酶吗？还有一个问题，重泡胀液中的ＤＴＴ浓度为多少？

• junhun (2014-6-08 11:34:42)

  加了PMSF,下次准备加Roche的Protease inhibitor cocktail,估计效果会更好点
  DTT 浓度65mM(每1ml体系加0.0098g,具体为称取少于0.01g的DTT,然后加入相同数据的上样/裂解buffer分装液中,如称的是0.0092g,则加入920ul左右的分装液,分装液可适当减小)

• orangecake (2014-6-08 11:35:01)

  请问,你PMSF是用什么配的?它遇水很快分解,说明书上是用醇配的.
  还有,你的DTT是现用时现加粉末的?(就是现用时将DTT粉末加在裂截液中的?)

• junhun (2014-6-08 11:35:22)

  
  PMSF是100×的,从其他实验室拿来的，不是自己培的,好象PMSF是用异丙醇配的,DTT是现加粉末的(称0.09AB克的DTT,然后加9AB ul的分装液)

• orangecake (2014-6-08 11:35:44)

  请问你最近做了没有?你可以将聚焦时间稍微延长到50000-60000VH看看结果有没有好些!

• 66+77 (2014-6-08 11:36:05)

  第一次跑的Ag染就这么好，很佩服啊！

• kuaizige (2014-6-08 11:36:28)

  请教：请问你的图是用什么照的？是直接用相机照的吗？