【讨论帖】western blot 中抗体的重复应用问题

最新回复

• DONT (2014-3-10 17:49:22)

  
  抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3次。稀释后应在2－3天内使用，4度保存，避免反复冻融。

• yes4 (2014-3-10 17:50:00)

  
  抗体可重复使用3次一般没有问题，可以-20储存，且夏天最好放-20储存，这样可以保存时间长一点。

• bamboo16 (2014-3-10 17:50:20)

  
  本人建议：
  稀释的抗体可以在4度下放1个月左右，不会影响抗体的效果，前提是加入0.2％的NaN3防腐，绝对可行，本人曾经用一个磷酸化抗体也是CS公司的p-erk用了2个月，到后来是牛奶都很淡了，照样信号很强的

• yonger (2014-3-10 17:50:45)

  本人曾经用一个磷酸化抗体也是CS公司的p-erk用了2个月，到后来是牛奶都很淡了，照样信号很强的
  
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  我个人认为是不是即使牛奶很淡了，目的蛋白含量仍然很高，所以不影响结果呢？牛奶里的beta-Casein, alpha-Casein 等都是高磷酸化的蛋白，而且在牛奶里含量都很高。

• moonlight45 (2014-3-10 17:51:08)

  你好：我很理解你的心情，因为我也出现过这种情况，我这几个月光做western blot 了，我在这里谈谈经验,希望对你有帮助，你近期的一个帖子我也回答了，你注意查看一下：
  1。做western blot 时转膜是一个分水岭，用丽春红染色后（5‘）看条带有无或是否清晰，你所说的没结果到底是怎么个没结果。如果膜上没有条带或条带不清晰，那肯定是蛋白制样和转膜的问题。如果条带清晰而没有结果，就应该依次排除一抗，二抗，和ECL的问题，你抽几微升二抗点在一个新的小NC膜上，等二抗干了以后，连同要杂交的NC膜同时曝光显影，如果小膜上有黑点，而你要杂的蛋白没有条带，那肯定是一抗有问题，如果小膜上没有黑点，那二抗和ECL两者有一个有问题或都有问题。你也可以设计其它方法检测你的实验试剂和步骤是否没有错误。
  2。封闭液最好用脱脂奶粉配，一抗用5％BSA加0。02％的叠氮钠在4度至少可以保存一个月，禁止反复冻融，二抗也用脱脂奶粉配，4度可以保存一个星期。
  3。具体实验方法参见分子克隆第二版。

• is2011 (2014-3-10 17:51:59)

  
  看到有这么多的人回应，真是太感动了，最近在放假期间，实验室的人特别少，我每天做实验感觉都与世隔绝了。我现在是用立春红染色，可见不清晰的条带，但是暴光后，底片上什么都没有。另外我想问的是用BSA稀释的抗体加入叠氮钠后是否会影响抗原与抗体的反应，且问一下，10ml的抗体可用几次？并且问一下Western的结果如何分析，难道一定要做内参照吗？

• yonger (2014-3-10 17:52:19)

  帮您查了一下，到处也没有找到叠氮钠防腐的机理。
  叠氮钠是“弱氧化剂”，因为两个N 之间的三键，导致该化合物有夺电子的能力。而电子是一些细菌病毒复制再生所必须的。查了一下PUBMED，只有叠氮钠影响酶功能的文章，没有说到影响抗原抗体结合。

• 8princess8 (2014-3-10 17:52:36)

  如果担心叠氮钠对后面的影响，可以考虑过滤除菌。优点是不用担心叠氮钠的影响，缺点是保存的过程中也要注意无菌。
  另外，如果样品中目的蛋白含量很低，转移后用丽春红并不一定能染出条带，特别是真核表达的产物，一般表达量不高，蛋白量少。我有几次真核表达产物转印后，丽春红染未见条带，接着做下去，结果仍然出来了。

• ha111 (2014-3-10 17:52:53)

  
  抗体我用western blot C液稀释后，使用大概有5～6次，每次用完回收放于4度保存。最近再用只是显色浅，还能用。

• orangecake (2014-3-10 17:53:09)

  
  我WESTERN时：
  转膜用36V，18MA,20小时。
  marker可以转上。
  丽春红染色，膜上没有明显的条带，可见蛋白泳道影，向刷子刷得一样。
  靠马斯亮蓝染胶，胶上仍可见蛋白条带。
  不知问题处在那里？
  谢谢！

• 33号 (2014-3-10 17:53:25)

  0次都没关系,加NaN3,放-20度一年没问题,我这么说,试剂公司可要骂我了,没骗你!!

• greenbee (2014-3-10 17:53:44)

  不知你用的是哪种仪器转膜，
  电压和电流是不是太小了？转膜时间太长了。
  我们用Bio-Rad公司的转膜仪，如果按稳压条件，
  是100V，2小时。

• zsxan1990 (2014-3-10 17:54:06)

  
  如果你的二抗连的是POD，叠氮钠会影响其灵敏度，所以这种情况下不要加

• wmp1234 (2014-3-10 17:54:22)

  
  我用的是Bio-rad公司的转膜仪，350mA，一小时，至今没有失败过
  关于抗体，最好不要重复使用

• bs4665 (2014-3-10 17:54:45)

  我的一点意见：
  1. 一抗价格很贵的话，可以考虑反复用的。孵育液中，－20反复冻融3－4次做绝对没有明显信号减弱的情况。我在美国的师兄说他们是milk & 叠氮钠 & 4度，用一个月，绝对没问题。
  2. 还有一个方法，不知道你们是怎么孵育的？我一抗一般用量很少。10 lanes的膜也只用到2ml孵育液，可以用封口膜，剪一块，对摺，把膜放里面，加上一抗孵育液，然后放在室温或4度，不用shaking的，我们实验室一直这么做，效果很好，很节约。
  3. 二抗便宜，我一般就用一次，也用培养皿 & 足够量的孵育液，shaking了。

• am10 (2014-3-10 17:55:02)

  我的一抗用了3到4次后目的条带就开始弱了。
  做DAB显色还可以
  如果是做ECL，目的条带就明显减弱了。很奇怪哦

• bs4665 (2014-3-10 17:55:25)

  QUOTE:

  原帖由 am10 于 2014-3-10 17:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  我的一抗用了3到4次后目的条带就开始弱了。
  做DAB显色还可以
  如果是做ECL，目的条带就明显减弱了。很奇怪哦

  1. 是的，如果－20度反复冻融的话，4次以后我就不用它做ECL显色的western了。
  2. 还有就是抗体本身质量好坏的差异也会造成信号减弱的。我比较过，我买的进口的一抗、国内分装的一抗或自己做的抗体，可以反复使用的次数都不一样。因此，你对自己常用的一抗可以先摸一下条件，看看在相同的其他条件下（上样量、转膜状态、等等）会出现什么情况，以后就可以按照这个条件进行实验了。
  3. 所以不是很奇怪的，呵呵。

• orangecake (2014-3-10 17:55:44)

  
  我的一抗用含脱脂奶粉的TBST稀释，能否加叠氮钠？如果可以，加多少？我看上面的帖子有的说0.2％，有的说0.02％。望诸位高手快快告知，明天就要稀释宝贵的一抗了。THANKS.

• nn255 (2014-3-10 17:56:06)

  可以，0.02％

• PINK (2014-3-10 17:56:30)

  
  没有稀释的时候抗体在-20℃下不结冰应该是加了甘油，甘油通常能有效地增强蛋白质的稳定性，并且使蛋白质能在-20℃不结冰状态下保存。我现在用的博士德的抗体产品中含有30%的甘油，你看看你购买的抗体产品的说明书就知道了。
  防污染可添加0.02%的叠氮钠，或0.01%的硫柳汞。叠氮钠能阻断细胞的电子传递链，对许多生物体都有毒性，因此不能用于活体实验；因为含有氨基而能干扰许多标记方法（不过在我的实验里有一步是会受氨基影响的，但在这一步中我做了对照，发现叠氮钠并没有对我的实验产生什么不良影响）；不能用于辣根过氧化物酶标记的抗体。而硫柳汞不含氨基，不影响基质的稳定性。
  容器壁对蛋白质的非特异性吸附可以造成蛋白质变性，因此在稀释的抗体溶液中加入BSA是很有必要的。