CPSA 2013分会:大分子的生物分析

2013-5-05 11:59 来源: 分析测试百科
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  2013年4月24~26日,第四届中国上海化学与药物结构分析会议 (CPSA Shanghai 2013)在上海浦东新区淳大万丽酒店召开,来自国际知名药企、跨国大制药公司、中国CRO、生物医药研究所和高校的高管、专家、学者两百余人参加了本次会议。其中在4月25日的分会上,举行了以“大分子的生物分析”为主题的研讨会,来自WuXi AppTec(药明康德)公司的Dong-Bei Li女士,来自Frontage Laboratories的John Lin先生,以及来自Bristol-Myers Squibb公司的Guowen Liu先生,分别做了相关的报道,来自ICON公司的Daniel Tang主持了该分会。

    

CPSA 2013 大分子的生物分析 分会,主持人:ICON公司的Daniel Tang

  WuXi AppTec(药明康德)公司的Dong-Bei Li(李冬蓓)女士

  首先,做报告的是来自WuXi AppTec(药明康德)公司的Dong-Bei Li 博士,她带来的报告是“Challenge in method development  -When small molecule meets large molecule assay”(方法开发的挑战——当小分子遇上大分子)。

  李博士首先讲到,配合基键联(ligand binding)方法用于小体积的分子时,具有一些缺点及优点。缺点是:缺乏特定的专一性(没有内标,保留时间或质量标志特征),依赖于试剂(如抗体),较窄的定量范围(非线性曲线拟合);而其具有的优点是:高灵敏度(达pg/mL级,LC-MS/MS常为ng/mL),仪器不贵。接下来,李博士介绍了两个例子:一个是用生物标志物方法测定雌二醇,一个是用PK方法测定ABC-101。

   第一例为测量人体中的雌激素水平。雌激素影响各种包括发育期和再生能力在内的生物过程。雌激素水平在绝经期后的妇女中急剧下降。在循环系统中,>85%的雌激素是键联的血清蛋白。该实验开发了一种分析人血浆中全部雌激素的分析方法,用于支持评估对于绝经后的、局部晚期或转移后的乳腺癌患者,用抗癌药治疗临床前III期的研究。雌激素分子量为272,现有主要方法是LC-MS/MS,LQC=375 pgm/mL。在用1-二甲氨基萘-5-磺酰氯(dansyl chloride)衍生后,离子对从272.3/156.3变为506.4/171.1,信号灵敏度提高了15倍,方法LQC从非衍生的375pg/mL到衍生后的25 pg/mL。L/MS/MS法的方法曲线显示,灵敏度下限到10 pg/mL,但第一批临床样本的几乎100%浓度都<10 pg/mL,所以该实验停止,改用免疫法(immunoassay)。该实验的挑战是:样本整体分析时间限为5个星期,大多数样本已用LC/MS/MS法分析过,仅剩余有限的体积,所以需要一个可靠的方法,避免重复分析。从技术上来看,挑战为:>85%的雌二醇是键联到血浆蛋白上的,对灵敏度要求高,需达亚pg/mL。接下来,从所有的雌二醇试剂供应商中,筛选出达到灵敏度要求(pg/mL级)的两个产品,然后通过实验最终选择Salimetrics kit。但实验中发现其灵敏度仍不够,并有较强的基质效应。后采用1-氯丁烷萃取,再进行ELISA方法的优化,最后形成了样品的分析方法。该方法释放了键联的雌二醇,消除了基质效应,并浓缩了样品2倍。总结来看,该实验开发了一种检测血浆中雌激素的方法,并获得1 pg/mL的检出限,获得了成功的方法确证,日内、日间的CV% < 25%, AR < ±25%;并成功分析了样品,99%的样品获得确证的结果,通过了ISR(24/28,±30%),满足了时间期限,获得了客户满意。  

   第二例分析人血浆中一种脂肪酸修饰的药,具有40个氨基酸,要求达到20 pg/mL灵敏度,抗体可获得。夹心(sandwich)ELISA法,在用蛋白沉淀处理后,样品被浓缩4倍,再用ELISA法。进行这种样品处理后,虽在高浓度灵敏度提高,但在低浓度无优势。这时考虑用玻璃样品管替换塑料管,并在重组后的缓冲液中添加1%BSA和0.05% Tween 20,获得好的结果。总结来看,该方法适用于小分子或肽,优势是可浓缩样品,减低基质效应;限制是需要更多的样品处理步骤,仍旧要求抗体试剂;可在以下几方面考虑:处理方法,保留配合基键联的活性,提取,体积,储液池等,提取效率和重现性,标准曲线或非提取的标准曲线。

  Frontage Laboratories的John Lin博士

   来自Frontage Laboratories的John Lin博士,做题为 A Generic approach to antibody(mAb)quantitation in clinical samples by LC-MS/MS (临床样品中抗体定量的通用LC-MS/MS方法)。林博士首先综述了LC-MS/MS的蛋白定量方法,然后举例,接着谈到LC-MS/MS的方法开发和方法确证,确证结果,用ELISA法进行交叉确证,在临床样品分析中的应用,和未来的展望。

   林博士首先谈到,全球制药工业已从小分子向大分子药物研发转移。美国FDA现已批准了超过600种生物药;全球合成的治疗用肽的市场已从2003年的53亿欧元增长到2013年预估的115亿欧元;2012年全球生物药物的研发费用已超过了小分子的研发费用。

   在大分子定量中,林博士逐条对比了ELISA法和LC-MS/MS法的灵敏度、通量、开发时间、专一性、精密度和准确度、动态范围、分析成本等。对于多数蛋白定量的LC-MS/MS法来说,均要求通过它的代表性肽(surrogate peptide)酶解和定量,仅有以下情况例外:较小的肽,因其无需酶解即可碎裂;以及少数报道中,用高分辨HRMS可定量完整蛋白。定量包含三个步骤:(1)酶解前分离(选项),(2)酶解(必需),(3)酶解后的分离(选项)。在第(1)步中,主要是将感兴趣的蛋白从内源蛋白中分离出来,从而减少干扰、信号抑制、对酶的消耗。第(2)步包含还原、烷基化、酶解(主要为Trypsin)感兴趣的蛋白。第(3)步主要用固相萃取法。

   关于样品净化,林博士谈到其主要是具体情况具体分析,根据蛋白的性质和纯化试剂的可获得性。包括免疫捕获(ImmunoCapture);用Protein A/G,anti-IgG抗体进行通用的免疫捕获;蛋白沉淀或固相萃取;蛋白沉淀;不采用任何酶解前的分离(没有蛋白水平的分离)。

   在内标(IS)的选择上,可用同位素标记的蛋白做内标;用蛋白类似物做内标;或同位素标记的肽做内标。

   接下来,林博士谈到具体实例,分析BAN2401,它是一种人类的IgG1 mAB,作为治疗阿尔兹海默病的潜在药物。临床前I期的药代动力学研究中使用了ELISA法,但存在以下问题:灵敏度不够(LLOQ为6ug/mL),主要的Ab是限制供应的,而希望的定量下限LLOQ要达到血清中500 ng/mL。改用LC-MS/MS法时,采用了如下的策略:(1)选择出代表性(surrogate)肽,(2)LC及MS/MS的方法优化,(3)样品处理法的探索(通用富集步骤,Protein A,Protein G,Anti-IgG1抗体),孵育,酶解;(4)内标的比较(抗体类似物 vs 氘代的surrogate肽)。胶内酶解后,选择了两个肽段,作为替代的肽用于后续分析。灵敏度比较后,选择一个HT9(2+)肽段作定量。再选用MORAB-022蛋白类似物作为内标,酶解后选择ANSVWFR(2+)做内标肽。

  在样品处理方法比较中,实验表明Anti-lgG1抗体富集蛋白效果最佳。在定量时,有一组MRM通道用于定量,一组MRM通道用于确证。最后的实验结果证明,灵敏度、定量限、精密度等都达到了要求。方法进行了确证,并和ELISA方法进行了交叉对比。该方法成功地完成了临床前I期样本的运行,如果提高通量,将可以支持临床前II期的研究。林博士还提出了更多的改进方法的展望。

   林博士最后引用CT Viswanathan的一段话(Bioanalysis, December 2012, Vol. 4, No.23, 2763-2764)来展望:一旦新技术的利益风险比是有利的、明确的,可能具有实质性的数据(如果没有广泛的数据的话),监管环境将会拥抱新的技术。然而,在生物分析的科学社区和法规部门之间的合作,最好定位于:加强新技术的整体利益和可持续推动创新。

 

Bristol-Myers Squibb公司的Guowen Liu博士

   来自Bristol-Myers Squibb公司的Guowen Liu博士,做了题为“生物治疗药物中LC-MS/MS的生物分析法”(LC-MS/MS Bioanalysis of Biotherapeutics in Drug Development)的报告。

   刘博士首先谈到用LC-MS/MS法支持生物治疗药物的药代动力学/毒代动力学(TK/PK)研究的现状。人们对LC-MS/MS应用于生物治疗药物的定量都很感兴趣,其使用的可能性也已被展示,但其应用还有一些限制,比如还没有被法规部门明确接受,灵敏度还有限制,实验人员的操作方面也有挑战。

   在刘博士最近发表的论文(Liu G, et al. J. Chromatogr. A. 1284(2013) 155-162)中,他对LC-MS/MS用于生物治疗药物的方法做了详尽分析。对于基质为血浆或血清的生物样品,如果易于提取的话,就采用LLE、IA、蛋白沉淀等方法提取出来目标的蛋白,然后进行酶解,加入可溶性肽(SIL-Peptide)内标,再考察灵敏度,若足够就直接采用LC-MS/MS法确证,如不够则进行再处理(post digestion cleanup/enrichment)净化、富集。而最初的样品如果不易提取的话,可将样品和血浆/血清基质一起酶解,再进行LC-MS/MS分析或处理、富集后再分析。

   接下来刘博士举了三个例子,第一例是定量猴血浆中的BMS-X,这是一种pegylated的药,其中Peg(聚乙二醇)为40 KDa,蛋白为11 kDa。定量监测一个代表性肽,用pegylated的类似蛋白做内标,LC-MS采用:Shimadzu Nexera和Sciex Triple Quad 5500,样品制备方面,在酶解前采用液液萃取(LLE),酶解后没有进一步的净化步骤。实验进行了方法确证,包括准确度、精密度偏差,稳定性,交叉残留,回收率。该方法的确证已通过了小分子的准则。

   第二例是定量血清中的单克隆抗体BMS-Y,分子量约为145 KDa,定量监测一个代表性肽,用可溶性肽SIL-peptide(酶解后加入样品)和突变蛋白Mutated protein(一开始加入样品)做内标,LC-MS采用:Shimadzu Nexera和Sciex Triple Quad 5500,样品制备方面,在酶解前采用蛋白沉淀法,酶解采用pellet digestion方法,酶解后没有进一步的净化步骤,整个样品制备时间小于2小时。该例中,刘博士提到采用了一种特殊的酶解方式pellet digestion(Zheng ouyang et al.Bioanalysis, 2012 Jan;4(1):17-28)。实验比较了采用可溶性肽内标和突变蛋白内标定量的结果,没有明显的差异,证明该酶解是一致性的。实验进行了方法确证,包括准确度、精密度偏差,基质效应、酶解重现性、选择性。并比较了LC-MS/MS法和ELISA方法的药动曲线,一致性很好,结果显示92%的样品测定偏差在15%以内。

   第三例是定量BMS-Z(a domain antibody with a Fc tail),分子量约为80 KDa,定量监测两个代表性肽,Peptide A为dAb和Fc间的连接子,Peptide B为一个存在于所有人的IgG1,2 Fc tail的常见蛋白。内标采用SIL-Peptide A和SIL-Peptide B。MS采用:Shimadzu Nexera和Sciex Triple Quad 5500,样品制备方面,酶解采用pellet digestion方法,酶解后没有进一步的净化步骤。实验进行了方法确证,包括采用Peptide A和Peptide B定量的准确度、精密度偏差;两者的精密度、准确度都很高,Peptide A的长期稳定性更高。采用ISR(Incurred Sample Reanalysis,真正样本再分析),Peptide A稀释或不稀释时都具有高度的重现性,而Peptide B的测定值大都比Peptide A高,两者测定结果不一致,说明Peptide B可能不适于做BMS-Z的代表性肽。实验比较了LC-MS/MS法和ELISA方法的药动曲线,7天内两者吻合度很高;超过7天后,LC-MS/MS的测定值要高于ELISA法,这可用免疫原性(immunogenicity)来解释。整体看,Peptide A和Peptide B的样本分析结果在方法开发和方法确证时是一致的。

   最后刘博士总结,应用现有的标准,几种不同类型蛋白的LC-MS/MS法可被确证;LC-MS/MS和ELISA法结果比较一致;LC-MS/MS法是一种优良的生物分析法的补充性技术;需要仔细地选择出正确的代表性肽,因为不是所有的肽都可以代表整个蛋白的。