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【讨论帖】也谈Real-time PCR引物设计
【讨论帖】也谈Real-time PCR引物设计
先谈引物设计原则，再讲实施方法。
引物设计不仅对引物有要求，也对PCR target有要求。
Design guidelines for primers:
Primers:
1 length
18-24
2 GC content
35%-65%(ideally 40-60%)
3 Tm
60-70°C (ideally 65°C), so that annealing temperature is 58-62°C
ΔTm (forward primer and reverse primer)<4°C
4 3’ end
Avoid 3’ end T (allow mismatching), G or C is better
No more than 3 G+C at the 3’ end in 5 nucleotides
Avoid runs of identical nucleotides, especially of 3 or more Gs or Cs at the 3’ end
5 Avoid hairpins
6 Avoid complementarity between the primers, especially at the 3’ ends of the primers (2 or more bases) to avoid primer-dimers
7 Take into account alternative splicing
8 Take into account into known SNPs
9 If Oligo-dT is used in RT, keep close to Poly-A tail
10 Design intron spanning or franking primers to avoid co-amplification of genomic DNA, which is only possible in multiple exon genes. (For single exon genes, perform DNase I treatment of RNA samples)
11 Use software (Oligo) to detect false priming sites in the template mRNA sequence to enhance the specificity of priming and avoid the low-complexity regions
Amplicon
1 SYBR green I assays:
80-200 bp (ideally 80-150). Alternative length ranges are often used to satisfied other requirement, but remember that shorter amplicons would give higher PCR efficiencies
2 GC content
30-80%(ideally 40-60%)
3 Avoid secondary structures in the amplicon (check with mfold)
4 Check if generate amplicon is unique
Discriminate cDNA from genomic DNA
Discriminate cDNA from pseudo-genes. If pseudo-genes exit, multi-align the sequences between the gene and it’s pseudo-genes to make sure the difference region to help you to design the primers
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【讨论帖】也谈Real-time PCR引物设计
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最新回复
箭头儿 (2015-8-01 15:39:44)
引物设计和cDNA priming的关系
常常对选择random primers 和 Oligo-dT很迷惑，到底哪种priming strategy更好呢？
实验的方法是：
用同样的reverse transcriptase ，两种priming strategy去做RT，进行real-time PCR，相同体积的cDNA，那个的Ct值小，说明priming的效果好。
在引物设计要考虑的是：
如图所示，
1 如果基因没有poly-A tail，那么直接就random primers 好了
2 如果基因有poly-A tail
对于小的基因，选择Oligo-dT 作为priming strategy
对于大的基因，要选择Oligo-dT 去priming，引物设计在3' end，选择random primers，引物设计在5’ end
这是一个一般的概念，没有绝对的标准，比如基因有3000bp，那么是设计适合Oligo-dT 使用的引物还是random primers 使用的引物，在于你实际研究的几个基因的情况，其中也有很大的人为成分。最好的再用实验来验证，但在引物设计中是需要考虑的。
63587615.gif
箭头儿 (2015-8-01 15:40:14)
SNPs和假基因
引物设计有很多原则去遵守，这两个问题常常让我们无从下手
1 SNPs
这个东西先不用考虑，等你设计好引物了，在相应web program去check一下就可以了，如果不行就再做一遍设计。
2 pseudo-genes
这个是需要提前考虑的，从NCBI上下载gene和它的 pseudo-genes，比对后找出不同的序列，在这些序列上设计引物，保证一条引物在这些序列上，另一条可以是，也可以不是，以降低设计的难度。
如果不好设计，不管这个问题，其一实际做real-time PCR时，pseudo-genes可能不产生影响，举例子hGAPDH，大多数hGAPDH的引物是能扩增出pseudo-genes的，但在使用template浓度下pseudo-genes所产生的Ct值贡献很低（记住和template浓度有关），所以大家还在使用。其二genome DNA可以用on-column digest 来处理。
箭头儿 (2015-8-01 15:40:31)
我们常常会看到这个图：
左边的一种情况是内含子跨越引物（intron spanning primer），图中可见Forward引物是由Exon1的尾部和Exon2的头部拼接而成，所以取为内含子跨越引物很为合理。
如果一侧是spanning primer，那么另一侧可以是spanning primer，也可以不是spanning primer，由于Amplicon的长度限制在80-200 bp ，所以如图这种情况，Exon2要小于200bp，这样才能保证Amplicon<200bp，所以基因结构很关键，如果序列中没有<200bp的Exon，就无法使用这种设计。
那么问题来了，如果Exon2大于200bp,是否可以把reverse primer设计在Exon2中，这种设计应该也是成立的。
所以图中的reverse primer可以是三种情况：1 处于exon2中；2 Exon2和Exon3的spanning primer；3 Exon3中
具体是那种情况，和基因结构密切相关，但1的严谨性要差一些。
右边的情况是内含子侧翼引物（intron flanking primer），引物位于Intron两侧的Exon上。
这种设计也是和基因结构密切相关，它的要求是Exon1和Exon2之间的Intron足够的大，以保证PCR延伸时含有Intron的genome DNA不被扩增。
总结基因结构是设计real-time PCR 引物最为重要的限制因素。
25190143.gif
箭头儿 (2015-8-01 15:40:47)
Real-time PCR的引物设计要求有很多方面，下面给出实施框架：
Outlline of Primer Design:
1 Investigate gene structure
UCSC or Ensembl
2 Select target area (exons)
Different exons (exon junctions)
3 Use software for primer design
Primer3:
cuturl('http://frodo.wi.mit.edu/')
Oligo6
4 Check primers using electronic PCR
cuturl('http://medgen.ugent.be/rtprimerdb/')
cuturl('http://bisearch.enzim.hu/?m=genompsearch')
基于这个框架，引物设计就变的简单了，只要经过这样一个procedure，就可以获得需要的引物，如果不能得到合格的引物，修正一下就可以了。
引物的设计要求在整个过程的不同步骤中得到实现，是有先后顺序的，这样可以使操作简化，也使这些条件得以兼顾。设计的任务是找到能够work的引物，而不是去找最好的引物，只要我们得到的引物通过了Check，那么It's fine，你就可以去Order这对引物了。
xue258 (2015-8-01 15:41:16)
Outlline of Primer Design:
1 Investigate gene structure
UCSC or Ensembl
2 Select target area (exons)
Different exons (exon junctions)
3 Use software for primer design
Primer3:
cuturl('http://frodo.wi.mit.edu/')
Oligo6
4 Check primers using electronic PCR
cuturl('http://medgen.ugent.be/rtprimerdb/')
cuturl('http://bisearch.enzim.hu/?m=genompsearch')
基于这个框架，引物设计就变的简单了，只要经过这样一个procedure，就可以获得需要的引物，如果不能得到合格的引物，修正一下就可以了。
引物的设计要求在整个过程的不同步骤中得到实现，是有先后顺序的，这样可以使操作简化，也使这些条件得以兼顾。设计的任务是找到能够work的引物，而不是去找最好的引物，只要我们得到的引物通过了Check，那么It's fine，你就可以去Order这对引物了。
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谢谢高手，但我觉得第一步可以先上这个网站看一看有没有现成的引物。这个网站收集了很多现成的实时定量引物，我很懒，一般我都先检索一下你上面 提到的这个网站。如果有现成的我就直接合成，还没有遇到不好用的时候。跟丁香园规定有点类似，设计（发帖）前先搜索。
cuturl('http://medgen.ugent.be/rtprimerdb/')
shenkunjie (2015-8-01 15:41:33)
先天性卵巢发育不全综合征46XX性发育睾丸疾病
cuturl('http://tong.dxy.cn/experiment/430/457/460/21713.htm')
这个正好有个相关的视频
am10 (2015-8-01 15:42:00)
不理解这些。我的疑问是：real-time PCR 主要是定量检测mRNA的水平。
设计引物的时候只需要以mRNA 序列为模板设计，和exon有什么关系呢？
成熟的mRNA 已经把exon 切除了吧！
刚接触这些， 不知道自己理解得是否正确。
箭头儿 (2015-8-01 15:43:19)
但还考虑不周全，因为在提RNA时，往往不能把基因组DNA去除的非常干净。
而一旦有基因组污染，就会导致误差。
这种设计引物的方法，即使有DNA污染，也不会扩增出来。
另外，成熟的mRNA是将intron切除了，把exon连接在一块了。
yhn (2015-8-01 15:47:57)
常常对选择random primers 和 Oligo-dT很迷惑，到底哪种priming strategy更好呢？
实验的方法是：
用同样的reverse transcriptase ，两种priming strategy去做RT，进行real-time PCR，相同体积的cDNA，那个的Ct值小，说明priming的效果好。
在引物设计要考虑的是：
如图所示，
1 如果基因没有poly-A tail，那么直接就random primers 好了
2 如果基因有poly-A tail
对于小的基因，选择Oligo-dT 作为priming strategy
对于大的基因，要选择Oligo-dT 去priming，引物设计在3' end，选择random primers，引物设计在5’ end
这是一个一般的概念，没有绝对的标准，比如基因有3000bp，那么是设计适合Oligo-dT 使用的引物还是random primers 使用的引物，在于你实际研究的几个基因的情况，其中也有很大的人为成分。最好的再用实验来验证，但在引物设计中是需要考虑的。
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非常谢谢这位大侠的无私赐教,另外我想补充下,如果各位想做相对定量,要用到内参基因,那么最好用random primer进行逆转录，因为polyT逆转录会对不同的模板转录产生偏差，认为引入了各个基因表达间的表象不同；特异性引物的逆转录更是严重，无法进行相对定量了，所以relative Q最好用random。
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