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【求助】请教两个有关RT-PCR的问题(循环次数...
1.我需要做RT-PCR,目的是半定量的差异比较,听说做半定量的比较循环扩增【求助】请教两个有关RT-PCR的问题(循环次数...
在平台期前结束,请教如何确定RT-PCR的循环次数?多少个循环合适?
2. 还有一个傻问题我这的凝胶成像系统只能成像,但不能测定灰度值,
如我电泳后将先在我这成像,成像的图片再哪到别处测定灰度值,
是否可以 ?结果是否同直接在别处成像是一样的?
请各位高手指教,万分感谢!
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最新回复
45778 (2016-2-09 22:20:46)
1 一定的PCR体系,设置不同的cycle,PCR产物电泳,可观察到band信号强度呈梯度,选择中间强度的cycle 作为最后的cycle.
2 可以,只要有分析软件就可以。
dog002 (2016-2-09 22:21:03)
凝胶成像系统的软件中可以分析得到.
eric930 (2016-2-09 22:21:21)
1.做循环次数和扩增产物量的曲线,即在不同的循环次数下(如从20个循环开始,然后依次递增2个,直到35个或40个,一般不会超过的,当然也可以适当增加一下间距,而且可以视基因,如管家基因则很早就达到平台期了,目的基因则不同,和其表达峰度有关)结束PCR,然后将各个循环得到的PCR产物电泳,拍照,测定条带的辉度,将循环次数作为横坐标(X轴),PCR产物量作为纵坐标(Y轴),作出曲线,可以用EXCEL作图,得到S形的曲线,就可以确定指数扩增期了
2.目前使用的凝胶成象系统都可以进行RT-PCR产物的定量,如BIO RAD公司的QUANTITY ONE,如果你的不能,那就将图片保存,然后找一个凝胶定量软件进行分析,这应该不难,可以问一下相关实验室,总会找到能定量的地方的.软件一般会根据你的照片背景自动扣除背景值,所以在哪里成象都无所谓,不会影响结果,只是麻烦而已.
qqshepherd (2016-2-09 22:21:37)
楼上的大侠:是不是还要根据不同的模板DNA量做不同的曲线?作图的时候用折线图就可以了吗?谢谢!
wood533 (2016-2-09 22:21:53)
zbboom (2016-2-09 22:22:10)
再请教一个问题,我在30个循环时进行PCR扩增,看到产物条带随模板量增加而增加,能说明30个循环在它的平台期前吗?
多谢!
nikonun (2016-2-09 22:22:29)
关于你说条带随模板数量增加而增加,那是当然的,你如果模板量增加一倍,即使在平台期,根据用一个PCR体系的效率讲,产物也应该增加1倍,因为你的起始值就查一倍,所以应该固定一个浓度测定不同循环的产物量,这样比较才有意义.起始摸板的数量可以决定你这个PCR反应体系的扩增效率,有的基因表达比较低,你可能需要适当的cDNA量才能获得比较清晰的条带,你可以设置一个浓度梯度来选择最合适的起始模板量.
yayya (2016-2-09 22:22:47)
vcve (2016-2-09 22:23:04)
必须要做不同的循环数,找出适宜的循环数,这在于预实验中是必须做的
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