【求助】 PCR结果只有引物二聚体

最新回复

• 1472583690 (2015-1-14 15:17:20)

  换个体系或者酶
  一般我们最高就是20ul的体系
  H2O：13.6、Buffer：2、Mg2+：2、P1/P2：0.4、dNTP：0.3、Taq：0.3、cDNA：1

• mingming0638 (2015-1-14 15:17:38)

  
  mix，引物等完全溶解了

• lixi559 (2015-1-14 15:18:02)

  用了两种酶都一样..不是越大体系的会越稳定？而且要割胶回收...20ul不够吧...这个应该不是关键的吧？
  

• lixi559 (2015-1-14 15:18:19)

  QUOTE:

  原帖由 mingming0638 于 2015-1-14 15:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  mix，引物等完全溶解了

  什么意思？是指等到引物和mix完全解冻？

• xue258 (2015-1-14 15:19:30)

  我们一般是50uL体系，质粒做模板的话不用加太多，只要质粒的质量够好，0.5uL和0.25uL我都成功过
  

• dragonkilly (2015-1-14 15:19:48)

  10ul的我都做过回收（加甘油），效果挺好的，没听说过体系越大越稳定的最近有个一样做PCR的怎么做都没扩出来，改了体系就扩出来了，只是提供一个参考而已
  

• kuohao17 (2015-1-14 15:20:20)

  是啊，在冰上完全融化，要不然会成分不均匀，也有可能导致失败的
  

• rxcc33 (2015-1-14 15:20:38)

  对啊  。那你先不用mix做做啊。

• toy (2015-1-14 15:20:56)

  er...做那么大体系p不出好浪费酶...-0-....

• toy (2015-1-14 15:21:42)

  网上好像是有看过加甘油的..加的量是多少？
  我是跟师姐做的，哈哈..她好像不太推荐太小的体系..
  哦哦哦..我是引物没融全就把加了...
  “取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的”有试过这个方法吗？

• toy (2015-1-14 15:22:04)

  er..我们实验室买的酶都是mix的..-0-..

• misswu61 (2015-1-14 15:22:26)

  不至于吧？1uL而已......

• toy (2015-1-14 15:22:48)

  QUOTE:

  原帖由 misswu61 于 2015-1-14 15:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  不至于吧？1uL而已......

  我们用的mix的，是加总体系的一半....-0-....
  

• ALALA (2015-1-14 15:23:11)

  
  这应该跟体系的大小没有关系哦，可能是溶解不完全或者酶出来问题吧。
  

• toy (2015-1-14 15:23:29)

  恩恩，我也觉得...我觉得貌似是引物都自己连接了..有没什么可行的方法？网上看过一些...但是有些方法好像有点囧...-0-

• flower@@ (2015-1-14 15:23:58)

  甘油的话，用100ul的枪，好吧，我们叫枪，一般可加5管，一管一滴。至于你说的那种方法，我没试过。体系么，可能每个实验室的习惯不一样吧。P.S：PCR的过程有时候让人又爱又恨的，这很正常，耐心点，good luck~
  

• nut6694 (2015-1-14 15:24:15)

  你再认真看看了，做实验细节至关重要了。如果再做还是那样的效果，那也只能死马当活马医了。

• toy (2015-1-14 15:24:36)

  那加的还挺多的啊..唉..今天还是做不出..明天试试那个方法好了...-0-...我的酶啊....两只都没多少了...上次p了个1500bp的也p得shi去活来的...

• toy (2015-1-14 15:24:53)

  和以前没什么区别，今天还做了两个梯度的..结果都没出.....还是只有又粗又亮的引物二聚体...这死马要怎么医...-0-...

• cocacola (2015-1-14 15:40:25)

  你看着加的挺多的，但是P完后没剩多少的。甘油，一般就10ul体系用的，20的话就不用的。PCR就是要细心，该加的东西不能少，该换枪头的要换，退火温度要摸索好的，东西都要在冰上完全融化。。。。。。实验么，慢慢来会比较快。