查看完整版本请点击这里：
凝胶过滤法分离蛋白质（二）
关键词：食品添加剂检测 环境监测标准物质 煤炭石油成分分析 标准品进口凝胶过滤法分离蛋白质（二）
2．装柱取玻璃层析柱(20cm×2．0cm)一支，垂直装好。加入缓冲液，打开出口，将气泡赶出，关闭出口。然后从管顶向柱内加入缓冲液8cm左右高，将平衡后的交联葡聚糖G．25悬浮液边搅拌边加入柱内，再打开出口，使液体流出，继续不断地加入交联葡聚糖G-25悬浮液，柱内凝胶柱床沉积至高25cm左右时为止。床面上覆盖3mL缓冲液，关闭出口，在凝胶柱面上加盖一层圆形滤纸，使层析柱稳定5～10分钟后，接储液瓶，打开出口，用2倍于床体积的磷酸缓冲液洗脱平衡，最后关闭出口。
凝胶柱的选择：层析的分辨率和柱长的平方根成反比。柱越长，分辨率越高。但太长又会影响流速。对于分离物质中分子量差别大的组分分离可采用柱长20～30cm；分子量差别小的组分分离采用柱长100cm乃至更长。
柱直径大小和样品用量有关，用于分析的层析柱直径为2．5cm。太粗会导致样本稀释；太细会产生壁效应。
3．样品处理
(1)血红蛋白溶液的制备：取革酸盐抗凝全血3mL离心，吸去上层血浆，加入5倍体积的冷生理盐水，混匀后3000r/min离心5分钟，弃去上清液，重复洗3次。最后一次吸去上清液后，在红细胞层上面加等体积蒸馏水，振摇。再加1/2体积CCl4，用力振摇3分钟，3000r/min离心5分钟。吸取上层澄清的血红蛋白液备用。此溶液中Hb浓度约为l0％(置4℃暂存，1周用完)。
(2)样品：血红蛋白液3滴加K3Fe(CN)68滴和蒸馏水2滴混合，制成MetHb混合样品。
4．上样、洗脱打开平衡好的层析柱出口，使柱内溶液流出至刚露出柱床面时即关闭出口。吸混合物样品0．5mL左右，在距离床面lmm处沿管内壁轻轻转动加进样品，切勿搅动床面。然后打开出口，使样品进入床内，直至床面重新露出。同上加入1～2倍样品量体积的磷酸缓冲液洗脱液(这样可以使样品定容至最小，而样品又完全进入床内)，当少量洗脱液将流入床面时，加入多量的洗脱液，但注意切勿搅动床面凝胶，连接储液瓶进行洗脱。
5．分部收集 用自动部分收集器，以5滴/分钟、5分钟/管的速度进行收集。并且观察柱上的色带，待黄色的K3Fe(CN)6色带完全洗脱下来后，再继续收集两管透明的洗脱液作为空白，关闭出口。
【结果计算】
将每管收集液加入缓冲液至4mL，混匀，在425nm处测其吸光度，以吸光度为纵坐标，管数为横坐标，绘出洗脱图谱。
【注意事项】
1．装柱后要检查柱床是否均匀，若有气泡或分层的界面时，需要重新装柱。
2．流速不可太快，否则分子小的物质来不及扩散，随分子大的物质一起被洗脱下来，达不到分离目的。
查看完整版本请点击这里：
凝胶过滤法分离蛋白质（二）
凝胶过滤法分离蛋白质（二）
凝胶过滤法分离蛋白质（二）