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《科学》文章复活蛋白

2007.8.22

来自北卡罗莱纳州大学化学系,俄勒冈州大学生态与进化生物学中心的研究人员“复活”了4亿5千万年前的一个蛋白:脊椎动物糖皮质激素和盐皮质激素受体(glucocorticoid (GR) and mineralocorticoid (MR) receptors),寻找引起这类受体进化的变化,这一研究成果公布在《Science》杂志上。

原文检索:
Published Online August 16, 2007
Science DOI: 10.1126/science.1142819
Crystal Structure of an Ancient Protein: Evolution by Conformational Epistasis
[Abstract]

X射线结晶学是一门阐述蛋白质、DNA或其它生物分子的原子水平的三维结构的技术。这种方法的运用是基于首先使纯化的生物分子结晶为有序排列然后用X射线分析结晶体。之所以使用X射线是因为其波长和原子裂解时的波长一样,所以晶体作为分子衍射光栅衍射X射线,产生一种可以获取并分析的衍射图形。然后用计算机重建初始结构。在实际操作中这一衍射图形被反复地不断升高的分辨率处理,结晶学家不断在建立一个模型结构并按该模型计算出的衍射图形与实际观察到的比较。每一次重复都使模型结构与实验结果更加吻合。当这两者之间的差异可以忽略时,这一衍射图形便得到求解。最终的模型提供了被研究分子平均时间上的三维原子水平结构。蛋白靶子的X射线结晶体结构可以识别蛋白质的功能袋。当与自然或人工配体混合时,可以作为药物设计的有用起始点。蛋白质X射线结构的目录也为蛋白质结构类型、自然状态下的折叠和域提供了有用信息。有时这被称为结构基因组学。

几年前,研究人员曾用重新构造遗传序列以及用在活细胞中合成的方法,将一个4.5亿年前的激素受体复活。现在科学家用这个复活蛋白祖先的晶体结构来寻找引起糖皮质激素受体进化的变化,糖皮质激素受体是该蛋白的一个现代后代。他们的研究为蛋白如何进化出新功能提供了独特的视角。通过确定从祖先蛋白到现代糖皮质激素受体的一系列突变,Eric Ortlund和同事提出,几个“允许”突变稳定了祖先蛋白一些位置的结构,为可能出现一些带来不稳定的突变铺平了道路,使受体得以与糖皮质激素结合。他们还发现,一个位置上的突变能影响其它不同位置的构象,扩大了第二个位置的新突变可能有用的可能性。

附:
蛋白质纯化与结晶
获得蛋白质的晶体结构的第一个瓶颈,就是制备大量纯化的蛋白质(>10 mg),其浓度通常在10 mg/ml 以上,并以此为基础进行结晶条件的筛选。运用重组基因的技术,将特定基因以选殖(clone)的方式嵌入表现载体(expression vector)内,此一载体通常具有易于调控的特性。之后再将带有特定基因的载体送入可快速生长的菌体中,如大肠杆菌(Escherichia coli),在菌体快速生长的同时,也大量生产表现载体上的基因所解译出之蛋白质。一般而言纯度越高的蛋白质比较有机会形成晶体,因此纯化蛋白质的步骤就成为一个重要的决定因素。

在取得高纯度的蛋白质溶液后,接下来就是晶体的培养。蛋白质晶体与其他化合物晶体的形成类似,是在饱和溶液中慢慢产生的,每一种蛋白质养晶的条件皆有所差异,影响晶体形成的变量很多,包含化学上的变量,如酸碱度、沈淀剂种类、离子浓度、蛋白质浓度等;物理上的变数,如溶液达成过饱和状态的速率、温度等;及生化上的变数,如蛋白质所需的金属离子或抑制剂、蛋白质的聚合状态、等电点等,皆是养晶时的测试条件。截至目前为止,并无一套理论可以预测结晶的条件,所以必须不断测试各种养晶溶液的组合后,才可能得到一颗完美的单一晶体(图一) 。

蛋白质晶体的培养,通常是利用气相扩散法(Vapor Diffusion Method) 的原理来达成;也就是将含有高浓度的蛋白质(10-50 mg/ml)溶液加入适当的溶剂,慢慢降低蛋白质的溶解度,使其接近自发性的沈淀状态时,蛋白质分子将在整齐的堆栈下形成晶体。举例来说,我们将蛋白质溶于低浓度(~1.0 M) 的硫酸铵溶液中,将它放置于一密闭含有高浓度(~2.0 M)硫酸铵溶液的容器中,由气相平衡,可以缓慢提高蛋白质溶液中硫酸铵的浓度,进而达成结晶的目的(图二)。

蛋白质晶体在外观上与其他晶体并无明显不同之处,但在晶体的内部,却有很大的差异。一般而言,蛋白质晶体除了蛋白质分子外,其他的空间则充满约40 %至60 %之间的水溶液,其液态的成分不仅使晶体易碎,也容易使蛋白质分子在晶格排列上有不规则的情形出现,造成晶体处理时的困难及绕射数据上的搜集不易等缺点。但也由于高含水量的特性,让蛋白质分子在晶体内与水溶液中的状态,极为相似。所以由晶体所解出的蛋白质结构,基本上可视为自然状态下的结构。

绕射数据的记录
X 光绕射点搜集,随着时间的推移,也由早期以闪烁计数器(scintillation counter) 一次记录一个点及使用许多X-光片(X-ray film) 拍下绕射点,每张X 光片都要经过显影的步骤;之后进而使用多重金属丝板(multiwire)自动记录每次侦测到的绕射点。目前使用的荧光记录板(image plate),则是利用磷化物经X 光激发后会产生荧光,经荧光扫描仪记录成数字模式的图像文件后,再以灯光照射一段时间去除记录板上的荧光点,即可再进行下一次的记录工作。电荷耦合器 (charge-coupled devices, CCD) 的出现及技术的改良,可以不断地记录绕射点,而不需荧光板扫描及去除步骤,如此将加速绕射点的搜集。目前的同步辐射光源几乎全部使用CCD 来记录绕射数据(图三)。
在实验室中的X 光光源的产生,一般使用铜作为旋转式阳极靶(rotating anode),可以产生波长为1.54 Å Cu Kα放射光。不过,以目前发表的文献来看,在同步辐射(synchrotron)光源所搜集的资料有增加的趋势,因为同步辐射所提供的X 光束,其强度较实验室强约百倍、甚至上千倍,同时它也可以改变不同频段的波长,以供非寻常散射(anomalous dispersion) 的实验研究

绕射原理
单一分子在X 光下的讯号极弱,无法被记录下来,然而在晶体中通常是由许多排列整齐的蛋白质分子所组成,当晶体内所有的分子(数量约在1015 个以上)一起在同一个方向上进行绕射且绕射波皆同步时,即足以使所产生的讯号被记录下来。每一个绕射波的强度与其振幅(amplitude)的平方成正比。但绕射波的另一个变数,绕射波的相角(phase),则无法直接测量得到,必须利用其他的方法方能获得(见相角决定方法)。若是绕射点振幅与相角都可获知,则可以进一步地来计算晶体中的电子密度图。
下列方程式即是著名的傅立叶转换公式,ρ表示在晶体中任何一个位置上(x, y, z) 的电子密度,φhkl 为绕射光相角,|Fhkl|为绕射光振幅,可由实验测得的绕射光强度开平方获得。
所以若是记录了所有的绕射波的强度(h,k,l),并计算出所有绕射光的相角,带入这个公式,蛋白质在晶体内的结构,就以电子密度图的方式呈现在我们的眼前了(图四)。
相角决定方法
决定相角通常有三种常用的方法,分别是同型置换法(isomorphous replacement method) 、非寻常散射法(anomalous dispersion method) 以及分子置换法(molecular replacement) ,现在分述如下:
(1)同型置换法
同型重原子置换法最早的应用是在1954 年,用来解出血红蛋白hemoglobin 的相角,需要在晶体蛋白质的内部加入重原子。通常以浸泡的方法使重原子能够渗透(diffuse) 进入到晶体内部和蛋白质结合。这些重原子对X 光产生较大的绕射,对绕射点的强度会有明显的差异,根据这些差异,可定出重原子的位置,并进而推算出蛋白质晶体绕射光的相角。理论上,若是只获得一组重原子衍生物数据(single isomorphous replacement, SIR),经计算后,其解并不是唯一的;因此通常会结合数个不同的重原子衍生物所得到的数据(multiple isomorphous replacement, MIR), 来求得更精确的相角。
(2) 非寻常散射法
较重的原子会吸收特定波长的X 光,运用接近吸收边缘(absorption edge)的X 光进行绕射实验时,会产生不寻常的X 光散射或吸收现象,称为非寻常散射(anomalous scattering),此一现象可导致绕射振幅及相角的改变。经由数个不同波长的X 光照射,记录吸收边缘前后所产生的不同绕射结果,可依此计算出相角。由于它使用数个不同波长,所以称为「多波长非寻常散射法」 (multiwavelength anomalous dispersion, MAD) 。使用这个方法的前提是X 光的波长需依重原子的特性加以调整,而一般在实验室的X 光通常是属于固定波长的,并无法满足这个方法,所以非寻常散射法就需要利用同步辐射可变波长的光源来完成(5)。目前很多实验室使用硒化甲硫胺酸 (selenomethionine)来取代甲硫胺酸 (methionine),在养菌的同时加入硒化甲硫胺酸,使蛋白质的形成过程带入含有重原子硒的硒化甲硫胺酸,接下来养出蛋白质晶体,在硒的吸收边缘进行绕射实验,并运用MAD 的方法来计算出蛋白质晶体绕射波的相角(图四)。
(3) 分子置换法
若是一个未知的蛋白质与另一已解出结构的蛋白质,在胺基酸序列具有30 %以上的一致性(identity),表示这两个蛋白质的结构可能类似,可以利用分子置换法来计算出未知蛋白质的相角。利用已知蛋白质之结构分子带入晶体中寻找旋转及位移的可能位置,解析出结构。随着蛋白质结构的增加,可以发现类似的蛋白质具有相同的折迭方式,而出现新的折迭的机率也相对减少,所以只要未知的蛋白质在蛋白质数据库(Protein Data Bank, PDB )中,找到序列上具有同源性(homology)的已知结构时,即可在取得晶体绕射数据后,快速地运用分子置换法来解决相角问题。

三维结构模型之建立及修正
藉由电子密度图的三维构形,可将每一个胺基酸依蛋白质序列建立蛋白质的起始模型。蛋白质的起始模型,常由于相角的解不够完美,使计算出来的电子密度图产生误差,误导模型的走向,因此需要做进一步的改善,称为修正(refinement)。修正的目的在于进行立体化学(stereochemistry)(如胜键键长、键角、胺基酸构形)优化的同时,减少计算与实验绕射点强度的差异,用来评估的数值则是「剩余值(R-factor)」:

其中 Fobs 及Fcalc 分别表示观察值与计算值的绕射光振幅。尽可能将剩余值降到最低,直到进一步的修正无法减少其值为止,即达最终的蛋白质结构模型。大部分修正后可接受的剩余值约0.2 (20%)。但低的剩余值,并不代表其结构就是正确的。已有数个例子显示在蛋白质结构上的某些部分不正确时,仍可能获得较低的剩余值。因此Brünger (7)在1992 年提出一个交互验证的程序,也就是取出部分的绕射点(建议为10%),排除于修正的程序之外,以对结构的正确性,提供个别的检查,称为「自由剩余值(R- free) 」,其计算方式同剩余值。除了剩余值外,分辨率是另一个判断晶体结构可信度的重要数值。分辨率在蛋白质晶体结构中通常是定义为:可以分辨二个平面的最小距离。分辨率对模型的建构所造成的影响,可以直接由电子密度图看出,在低分辨率(~6 Å )时,只能观察到由α螺旋(α-helix)所形成的圆柱形密度图;随着分辨率提高(3 Å ~ 2 Å ) ,主链与支链结构就会出现,但个别原子仍无法由密度图中看出,除非分辨率可以达到1.0 Å 或更高的分辨率。蛋白质结构所能达到的分辨率,主要是取决晶体内分子排列的整齐程度。小分子晶体内并没有太多的水分子,所以常能得到分辨率高于0.5 Å 的绕射数据。但因蛋白质结构由长的胜链所组成,其间又是由较弱的氢键及凡得瓦力所维系,造成蛋白质结构富有弹性,蛋白质分子与分子的堆栈也就没有那么整齐。同时分子与分子之间的空隙由水分子来填补,也因这些空隙的水分子排列比较紊乱,所以蛋白质晶体绕射出的结果,仅有少数高分辨率晶体,一般蛋白质晶体结构的分辨率约在2.0 至3.0 Å 之间。

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