无菌感染期线虫RNA的提取
实验概要
以培养诱导的无菌 S. carpocapsae A24品系感染期线虫为材料，提取高质量RNA，为后续cDNA的构建做准备。
主要试剂
1. 主要试剂
1) Trizol Reagent，美国Invitrogen公司；
2) DEPC，Bio Basic inc公司；
3) 氯仿、异丙醇，美国进口；
4) 溴化乙锭（ethidium bromide，EB），华美生物工程公司；
5) 其他试剂为国产分析纯。
2. 主要溶液
1) 溴化乙锭（EB）溶液（10 mg/mL）：称取EB约300 mg于试剂瓶中，加入双蒸水30 mL，充分混匀，4℃备用。
2) 50×TAE电泳缓冲液
Tris 242 g
EDTA (0.5 mol/L，pH 8.0) 100 mL
冰乙酸 57.1 mL
加水定容至1000 mL
主要设备
1. MDF-192型超低温冰箱，日本三洋电机株式会社；
2. UV-2102 Pc型紫外分光光度计，UNICO（上海）仪器有限公司；
3. CF43S超净工作台，Gelman公司；
4. 高速冷冻台式离心机，Heraeus Sepatech公司；
5. Capsule HF-120型微量离心装置，Millipore公司；
6. BL150S型电子天平，德国Sartorius公司；
7. GB 1302型天平，Mettler-Toledo仪器（上海）有限公司
8. XQ.WY21-600IIR卧式高压蒸汽消毒器，广州市医疗设备厂；
9. DYCD-31D型水平电泳槽，北京六一仪器厂；
10. EPS1001型电泳电源，Amersham Pharmacia公司；
11. 连续可调微量移液器，德国Eppendorf公司；
12. AlphaImager 2200型凝胶图像分析系统，Alpha Innotech公司；
实验材料
小卷蛾斯氏线虫 S. carpocapsae A24品系
实验步骤
1. 无RNA酶实验用品的处理
1) 8%洗液：80 g重铬酸钾溶于1000 mL水中，不停搅拌的同时缓缓加入100 mL浓硫酸。配制过程中注意不可使温度上升太快或不要出现铬酸结晶。
2) 0.2％DEPC水：100 mL 灭菌双蒸水中（125℃，灭菌1 h）加入0.2 mL DEPC ，用力振荡混匀，室温过夜，放于摇床上振荡，100 rpm；灭活剩余的DEPC（125℃，1 h），室温贮存。
说明：所有含氨基的化学物质（如：Tris，MOPS，EDTA，HEPES等）都不能用DEPC直接处理，而用DEPC处理过的水配制。
3) 玻璃器皿：烧杯、量筒、玻璃棒、试剂瓶、容量瓶等经洗液浸泡过夜，冲洗晾干，泡0.2% DEPC处理过的双蒸去离子水，约12 h，灭菌乐百氏冲洗，200℃，10 h 烘干，125℃高温灭菌1h。
4) 研钵，研棒及剪刀、镊子等工具200℃，10 h 烘干，125℃高温灭菌1h。
5) 塑料制品：枪头、离心盒、枪头盒等塑料制品应为一次性用品，在0.2% DEPC处理过的双蒸去离子水中浸泡过夜，125℃高温灭菌1h。
6) 比色杯：浓硫酸：甲醇（1：1）浸泡1小时，0.2% DEPC处理过的双蒸去离子水彻底冲洗。
7) 琼脂糖凝胶电泳槽的处理：去污剂洗净，水冲洗，乙醇干燥，装满3％的H2O2溶液于室温放置30 min以上，0.2％DEPC处理过的双蒸去离子水彻底冲洗电泳槽。
2. 感染期线虫总RNA的提取
采用 Trizol 溶液提取 A24 线虫的总RNA，按1 mL Trizol溶液处理100 mg组织样品的量。
1) 吸取0.4 mL的 Trizol溶液到-80℃贮存的线虫沉淀中，混匀，立即吸到已加液氮的研钵并研磨，再加0.4 mL的Trizol溶液到离心管中冲洗线虫残留液，并加到研钵继续研磨至粉末状，连同液氮倒入干净烧杯；
2) 使线虫粉末在室温静置30～45 min液化，再加入200 μL Trizol溶液，混匀，按每管1.1 mL分装到1.5 mL离心管(无RNA酶, 下同) 中；
3) 4℃，12000 g，离心10 min；
4) 取上清转入(约1mL) 已编号新的1.5 mL离心管中；
5) 室温静置5 min；
6) 每管加入0.2 mL的氯仿(0.2体积Trizol )，盖紧盖，剧烈振荡15 秒；
7) 室温静置3 min；
8) 4℃, 12000 g, 离心10 min；
9) 小心吸取上层水相，转入另一已编号新的1.5 mL离心管，测量其体积；
10) 加入1倍体积的氯仿，盖紧盖,剧烈振荡15秒；
11) 室温静置3 min；
12) 4℃，12000 g，离心10 min；
13) 小心吸取上层水相，转入另一已编号新的1.5 mL离心管；
14) 加入0.5 mL的异丙醇(0.5体积Trizol )，轻轻颠倒混匀；
15) 室温，静置10min；
16) 4℃，12000 g，离心10 min；
17) 小心吸去上清，加入1 mL75％的乙醇(预冷)，并轻柔颠倒，洗涤沉淀；
18) 4℃，7500 g，离心5 min；
19) 小心弃上清，微离，吸去剩余乙醇，室温干躁10 min；
20) 各管用50 μL DEPC处理过的双蒸去离子水溶解，分装，-80℃贮存（可贮存5周）；
21) 以紫外分光光度法和1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA浓度和质量。
3. 总RNA 浓度的测定（紫外分光光度计法）
取待测RNA样品10 µL至一洁净离心管中，加蒸馏水稀释到2 mL，转入到DEPC处理过的石英比色杯中，小心排掉气泡，以等体积蒸馏水进行空白测定，分别测定260 nm、280 nm及320 nm（参比波长）时样品的光吸收值。仪器自动给出RNA的纯度，根据公式计算RNA的含量：
RNA含量（µg/µL）=OD600×稀释倍数×40/1000
纯RNA样品的OD260/OD280比值为1.7~2.0，若低于该值，表明存在蛋白质污染，可重新用酚/氯仿抽提[94]。
4. 琼脂糖凝胶电泳
1) 将洗净、干燥的电泳模具，水平放置在工作台上；
2) 按需要配制的凝胶浓度，在1×TAE电泳缓冲液中加入琼脂糖，摇匀，在微波炉内将琼脂糖溶液以最短时间完全溶解，待冷却至60℃时，加入溴化乙锭（EB）至终浓度为0.5 µg/mL，充分混匀；
3) 插入适当的梳子，将温热的凝胶倒入模具中，凝胶厚度为3 mm～5 mm，置于室温下凝固；
4) 待凝胶凝固后，小心移去梳子，将带模具的凝胶置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，使液面高出凝胶1mm～2 mm；
5) 用微量移液器将样品与上样缓冲液混合并将混合液小心加入上样孔内，同时加入合适分子量范围的DNA分子量标准作为对照；
6) 盖上电泳槽盖，调节电压100 V，电泳45min左右；
7) 电泳完毕后将凝胶置于紫外透射检测仪上观察结果，用凝胶成像系统照相。
