干细胞：细胞重编程的黑匣子
“黑匣子”（Black Box），学名是飞行数据记录仪，是飞机专用的电子记录设备之一，可以记录飞机飞行期间的详细信息资料。
回首2014年，找不到“黑匣子”的马航（MAS）在12月15日告别吉隆坡股票交易所，结束为期29年的上市生涯。这一天，恰好也是韩国科学家黄禹锡的生日。
看到上述开头，你是不觉得这篇文章将黄禹锡和马航牵扯到一起很无厘头？请说NO！
因为最近加拿大科学家等研究者共同发现了“模糊细胞”（fuzzy，F细胞）被科学界称之为“Project Grandiose”（重大突破），《自然》杂志（Nature）也发表了一篇题为“干细胞：细胞重编程的黑匣子”的综述。本文是笔者读过原文后与自己的知识体系整合出几点感想总结。
约翰·格登为细胞重编程奠定理论基础
2006年科学家研究细胞重编程热情高涨
1996年7月5日，英国科学家伊恩·维尔穆特博士用一个成年羊的体细胞成功的克隆出了一只与它的“父亲”一模一样小羊Dolly。长久以来，科学家认为将细胞分化到胚胎状态的细胞重编程技术在创造体内所有的细胞具有非凡的能力。
1998年11月，威斯康辛州的科学家们宣布他们培育出了人体胚胎干（hES）细胞，这种细胞有潜力在体内发育成任何细胞类型。胚胎干细胞的多能性（pluripotency）为发育生物学和医学研究提供了很多可能的应用，但也带来一些问题。因为提取干细胞通常会毁坏胚胎，因此这项研究引发了生物伦理的激烈讨论，包括美国在内的很多国家都颁布了政治决策限制科学家对人体胚胎干细胞的研究。
2002年，当我第一次接触到中学生物教材时，老师告诉我“20世纪50年代， 英国发育生物学家约翰格登等研究发现蝌蚪成熟分化细胞的细胞核移植进入卵母细胞质后，能发育为成熟成体青蛙”、“1996年，英国爱丁堡罗斯林研究所胚胎学家伊恩维尔穆特，第一个研制出通过无性繁殖技术产生克隆羊多莉”……
那时的我还不懂得什么是“核移植”、什么是“细胞重编程”，听着老师在讲台上的唠叨“分化细胞能通过重编返回胚胎状态，胚胎状态的细胞能产生所有细胞甚至个体”，而我悄悄地在对着课本上可爱的克隆羊多莉发呆。
2004年，那年我14岁，听着老师跟我们很前卫地介绍细胞研究的最新成果：韩国科学家能用体细胞核转移技术、从各种疾病（如I型糖尿病、脊髓损伤和先天性免疫缺陷症）患者身上造出了新的干细胞。而紧接着的几天里，新闻里在循环播放韩国科学家黄禹锡的“干细胞研究”属于学术造假事件，在当时，为患者量身定做干细胞仍然遥不可及。
2006年，日本的研究人员将4个基因导入在培养皿中生长的小鼠尾部细胞，得到了外表和作用与胚胎干细胞极其相似的新细胞，并把这些新细胞称作诱导多能干（iPS）细胞，并被他们成为一个能避开人体胚胎干细胞实际与伦理问题的可能方法。主导这项研究的就是后来我们熟悉的山中伸弥教授，其在iPS细胞领域的研究让每一个干细胞研究者望尘莫及。
2007年，日本研究小组和两个美国研究小组将把细胞再编程技术应用到了人体细胞上，被选为《科学》杂志（Science）2007年十大科学进展第二名，这一成果为新研究又打开了一扇大门。
2008年，《科学》杂志（Science）评出的“年度十大科学进展”，细胞重编程（cell reprogramming）被评为第一位，使得这项研究几乎在一夜之间开启了一个生物学的新的领域，并有望成就挽救生命的医学上的进步。
2012年，山中伸弥教授和约翰戈登（约翰·格登在上世纪60年代通过核移植也成功让蝌蚪体细胞脱分化为细胞重编程奠定了理论基础）共同获得了诺贝尔生理或医学奖。
2014年12月，加拿大Lunenfeld-Tanenbaum研究所牵头的国际研究团队，日前以两篇Nature三篇Nature Communications的形式公布了细胞重编程研究Project Grandiose的最新成果：他们打造出来一种新型小鼠多能干细胞——F细胞。
什么是细胞重编程？
干细胞作为一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞：根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞；根据干细胞的发育潜能分为能干细胞、多能干细胞和单能干细胞（专能干细胞）。
细胞重编程（Reprogramming Cells）指的是分化的细胞在特定的条件下被逆转后恢复到全能性状态，或者形成胚胎干细胞系，或者进一步发育成一个新的个体的过程。
2008年，研究人员在用活鼠做的一项漂亮的研究中，他们让细胞直接从一种成熟细胞变成另一种，打破了细胞单向发育的规则，这为细胞重编程方面取得了又一个里程碑式的进展，并把细胞重编程这个现在蓬勃发展的领域推到了《科学》2008年十大科学进展之首。
为什么说干细胞是细胞重编程的黑匣子？
最初的细胞重编程方法靠病毒把再编程基因插入受感染细胞的基因组，从而永久地改变其DNA。但科学家们对这种方法比较担心，因为第一，插入的基因可能会打断现有的基因，例如防癌基因，导致细胞容易形成肿瘤；第二尽管插入的基因似乎在再编程结束后自动关闭、让细胞自身的基因接管，科学家们仍然担心插入的基因会再激活或者对细胞产生其它微妙的影响；第三细胞再编程需要更好的质量控制。
鉴于以上三点，世界各地的实验室都在寻找其它方法来引发细胞重编程。
宾西法尼亚大学细胞生物学家Ken Zaret对诱导早期48小时内这些分子的细胞内分布进行研究发现，这些分子竟然因为染色体结构变化导致和常规目标调节基因被物理阻断，这些分子转向调节其他可调节区域的基因，有时它们能激活迫使细胞自杀的基因，有时这些分子激活参与重编程过程的基因。因此MIT干细胞学家Rudolf Jaenisch将“山中因子”调侃为“滥交因子”。
这说明重编程过的细胞内部到底发生了什么仍然是个谜，似乎一些偶然事件的组合决定了哪些少数细胞最终会被重编程。目前一个主要理论认为：某些再编程因子首先帮助松动细胞核内的DNA，使重新激活关闭的基因变得更容易。随后其它因子帮助引发一个给细胞新身份的蛋白信号级联发生， 在分化为具体成熟细胞时，需要不同作用或不同的分子作用。
美国研究小组曾设法找到了一种极妙的方法，让科学家们可以在控制更严格的条件下研究细胞重编程的过程。他们制造了细胞，其中的再编程基因可以通过加入抗生素强力霉素来启动。然后，他们用重编程过的细胞生成基因完全一致的“第二代”iPS细胞，每个都含有相同的病毒插入体。这些细胞允许科学家们可以第一次在标准化条件下研究再编程的过程，助力揭示了能让成熟细胞在单向发育道路上找到出口的生物化学过程。
2011年哈佛大学干细胞学家Alexander Meissner小组发现一种能促进基因表达的组蛋白修饰H3K4me2在1000多个基因组位点发生了变化，其中许多涉及多潜能基因，而许多涉及成熟（成纤维）细胞的特定基因则相应减少，细胞的行为特征也发生了改变。Meissner说，开始认为这些因子导致了混乱，研究表明这一过程是有规律的，能够进行预测。
现在它们能明确哪个基因开始被激活，哪个可能被修饰，哪个将保持沉默。虽然对早期基因表达能够准确预测，但对下一步的细胞走向仍然无法预测。有的细胞表达新基因，但无法预测。即使H3K4me2修饰的细胞也只能到后期才会发生大量重编程特征基因表达，大部分细胞只能达到部分重编程状态，科学家仍然不清楚这个道理。
以色列雷霍沃特魏茨曼科学研究所的干细胞生物学家Jacob Hanna表示：尽管现在我们可以制作iPS细胞，且能够区分出其与普通细胞的差异，但是我们仍然觉得，我们对干细胞的认知还不足以控制细胞分化过程。
科学家将被称为“山中因子”的蛋白引入细胞会导致一系列基因表达，几天后这些细胞进入一个奇怪的状态，此时细胞分裂但似乎稳定，几周后，大约0.1%的细胞变成了多能干细胞。这个过程无法预测，科学家甚至不清楚那个细胞具体何时启动了重新编程过程。
科学家既不知道为什么诱导干细胞必须很长时间的等待，也不清楚为什么这种转变的比例那么低。山中伸弥教授认为细胞在分裂过程中，成熟细胞开始仍然习惯于表达原来的基因，虽然少数细胞能快速发生变化，也必然受到来自周围环境细胞的影响，导致这些细胞发生摇摆不定的分裂。培养细胞一般会出现各种不同的类型，外来基因产生的影响也必然不同，对这种细胞有效的基因，未必对其他细胞都有作用，他认为希望产生快速诱导的愿望也许根本不可能实现。
显而易见这属于诱导干细胞的黑匣子步骤：目前完全理解这一过程似乎不可能。
2014年：黄禹锡的“造假梦”成真 iPS细胞进入临床应用
2006年，韩国科学家表示能用体细胞核转移技术、从各种疾病（如I型糖尿病、脊髓损伤和先天性免疫缺陷症）患者身上造出了新的干细胞，而这一研究在当时因证据不足被视为“学术造假”。
为了使细胞重编程足够安全、能用于细胞疗法，研究人员必须找到一种高效、可靠的方法来引发细胞重编程。他们还要确切地搞清楚这个过程是如何进行的。科学家对细胞重编程的热情在高涨，由于细胞重编程种操作方法非常简单，几乎所有的实验室都可采用了这一技术，现在每年在这方面的论文超过1000多篇。
今年9月份，日本女科学家理化学研究所高桥政代让这一理论研究变为了现实，是干细胞由基础研究向转化医学的里程碑，这是人类首次将重组后的细胞移植到人类身上。
细胞重编程技术用于临床的担忧：低分化的细胞一旦进入了人体怎么办？
尽管 iPS细胞已经在日本进入临床应用，但是之前的疑问仍然存在，尽管许多科学家蜂拥而至般地研究细胞重编程，他们知道细胞如何分化出干细胞，但是他们并不知道在这一过程中的原理。
日本京都大学iPS细胞研究和应用中心的分子生物学家Knut Woltjen 表示：尽管我们尝试了用各种方法通过黑匣子，但是这其中的过程真的很混乱很负责，到底发生了什么真的很难弄懂。
干细胞生物学家认为，诱导开始阶段会出现多种细胞类型，一方面这一过程无法获得足够多的诱导干细胞，另一方面这些细胞中只有少部分能完全发生重编程，同时这些细胞也有可能发生逆转，需要科学家仔细调整培养条件才能获得理想效果，这正是诱导干细胞领域存在的一个困难，因为不同的实验条件可能会产生不同的结果，也给这种技术应用的安全性带来隐患。
因此，将分化出的干细胞通过细胞重编程诱导生成全能细胞时，如果遇到的是低分化的细胞将如何是好？
Project Grandiose：助力细胞重编程过程走向安全有效的应用
随着技术的进步，越来越多的技术开始助力观察图片。通过对单个细胞进行细致分析，积累了大量的详细的分子数据，生物学家可以更加深入观察细胞重编程过程中的一些重要事件。
最近发表在《自然》杂志上的一系列研究论文试图克服这一困难，科学家通过单细胞分析技术，确定了细胞诱导过程的一些关键分子事件，这是一项巨大的工程。由一个被称为“Project Grandiose”国际合作项目完成。
Project Grandiose涉及来自领先实验室的50名干细胞生物学和基因组技术专家，包括ANU）、悉尼大学、昆士兰大学、Victor Chang心脏研究所和QIMR Berghofer医学研究所。该组织关注重编程过程（称为表观基因组学、转录组学和蛋白质组学）的不同分子水平，识别哪些基因组合及其活性在中途改变。
加拿大多伦多西奈山医院干细胞生物学家Andras Nagy是该国际合作项目的负责人，他表示：将这项研究称为重大突破一点儿也不过分，因为这是第一次对诱导干细胞不同阶段进行的超精细分子动态描述。
科学家可以制造诱导干细胞，也可以让他们分化，但是精确控制这些过程十分困难。这正是获得足够理想的治疗用干细胞方面的技术难关。能实现这一技术当然是科学家梦寐以求的，为达到这一目的，首先要了解这些过程的内在分子特征，现在的研究结果给科学家向这一目标研究提供了重要基础。
Nature杂志及其子刊发表的系列论文代表了一项全球性工作，试图描述重编程期间不同细胞大分子类型的变化，并描述基因调控不同层次的模式。然而，在数据库中有更多问题有待发现和进一步探讨，现在通过stemformatics.org（澳大利亚干细胞协作平台），数据库是公开可用的。因此全球涌现出很多研究，以便更好地理解iPS细胞重编程，因为它可能有助于避免胚胎来源细胞的道德敏感使用。
Preiss教授说：“使重编程成为一个安全有效的过程，因此所产生的干细胞就可以广泛应用于治疗，相关研究工作已经相继开始。”经过标记重编程过程，这些科学家连续1月每天收集1亿个细胞，然后分析这些细胞的蛋白、RNA，掌握甲基化修饰等信息。甲基化修饰分析会产生海量数据，然后用超大硬盘分发给合作者。
这一合作研究获得了一个非常重要的成果，他们确定了一种新的诱导干细胞类型F-class，意思是fuzzy模糊细胞。胚胎中能分离到胚胎干细胞和外胚层干细胞。F-class细胞和这些细胞具有不同的特征，也不同于诱导干细胞。传统重编程方法中，达到多能性后宿主细胞表达的因子能沉默重编程因子。然而，F-class细胞的维持依赖于转录因子持续性的高表达。因为这种细胞无法满足最严格的干细胞测试，将这种细胞注射到小鼠胚胎无法产生嵌合体小鼠。有人认为不能算干细胞，最多只能算部分重编程细胞。Nagy认为虽然不能形成嵌合体小鼠，但能形成畸胎瘤，这种结构中存在多种细胞类型。
科学家现在希望将细胞进行分类以分析这个诱导过程的黑匣子。Woltjen研究发现，不同比例的重编程诱导因子能产生不同的诱导效率，一种配方有很高的诱导重编程效率，但是大多数细胞都是部分重编程的不稳定状态，难以获得最终理想诱导效率。而诱导重编程效率比较低的配方最终获得更高质量的诱导干细胞。
Nagy 认为这一发现好像是打开了一扇大门，应该存在更多类似的干细胞状态。
