【讨论帖】蛋白互作问题解答

最新回复

• uaubc (2013-10-07 16:30:02)

  
  感谢开帖答疑。
  
  不过不明白"蛋白互作"是什么?

• 89tongzijun (2013-10-07 16:30:22)

  应该是蛋白质相互作用的简称，呵呵。有时候是容易搞的人不清楚，就跟我在国内说PCR扩增的时候常说P一个基因，在给国外老板说的时候常常搞的人家一头雾水。

• yonger (2013-10-07 16:30:51)

  
  我有个大分子的蛋白，370多KD ，请问用什么内参好的呢？

• remenb (2013-10-07 16:31:23)

  感谢开帖答疑。
  
  不过不明白"蛋白互作"是什么?
  
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  蛋白间相互作用，受体，配体，蛋白与细胞。。。。相互作用

• remenb (2013-10-07 16:31:39)

  我有个大分子的蛋白，370多KD ，请问用什么内参好的呢？
  
  ============
  
  看你要做什么？

• 98776langtao (2013-10-07 16:32:04)

  
  正在做GST-pull down,请教以下问题：
  1，细菌裂解液和细胞裂解液的选择应该注意什么？我的bait蛋白目前研究不是激酶，prey蛋白可能是激酶有酶活性，这样的话蛋白裂解液应该如何选择？希望给推荐一下！
  2.在细菌中表达bait蛋白，诱导的量不太多，时间IPTG浓度温度条件都摸索过了，3-6小时差别不大，是不是形成了包涵体？如何优化条件？
  3.我用的是细胞裂解液与GST融合蛋白做binding实验，请问有没有较好的protocol？我们实验室多数是做TnT做体外的pull down,参考不多，亟待解决。
  4.接问题3，GST融合蛋白与细胞裂解液孵育的体系不知如何着手，用多少的蛋白裂解液合适呢？或者说多少的GSTbeads和多少细胞裂解液做结合？需要测蛋白浓度吗？
  
  谢谢！！

• yysr238 (2013-10-07 16:32:30)

  
  楼主，非介入式免疫共沉淀好作吗？我想免疫共沉淀后，作LC/MS不知道是否可行？

• 00无名指00 (2013-10-07 16:32:52)

  
  版主，你好，我有个问题想问你，蛋白质相互作用有哪些方法，有没有高通量的方法，谢谢！

• newway (2013-10-07 16:33:20)

  正在做GST-pull down,请教以下问题：
  1，细菌裂解液和细胞裂解液的选择应该注意什么？我的bait蛋白目前研究不是激酶，prey蛋白可能是激酶有酶活性，这样的话蛋白裂解液应该如何选择？希望给推荐一下！
  2.在细菌中表达bait蛋白，诱导的量不太多，时间IPTG浓度温度条件都摸索过了，3-6小时差别不大，是不是形成了包涵体？如何优化条件？
  3.我用的是细胞裂解液与GST融合蛋白做binding实验，请问有没有较好的protocol？我们实验室多数是做TnT做体外的pull down,参考不多，亟待解决。
  4.接问题3，GST融合蛋白与细胞裂解液孵育的体系不知如何着手，用多少的蛋白裂解液合适呢？或者说多少的GSTbeads和多少细胞裂解液做结合？需要测蛋白浓度吗？
  
  谢谢！！
  
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  1，BUFFER 可以多试几种，毕竟有些BUFFER会对相互作用有影响，很难判断，最好多试试
  
  2，如果不想要包涵体，可以试试换载体或者宿主菌，不同诱导起始OD。
  
  3，关键是不要影响蛋白间的相互作用，而非与GST的作用
  
  4，蛋白浓度可以试试，做一个非PD的对照。

• newway (2013-10-07 16:33:52)

  楼主，非介入式免疫共沉淀好作吗？我想免疫共沉淀后，作LC/MS不知道是否可行？
  
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  做做试试吧，不过个人觉得要注意目标蛋白的特性。

• newway (2013-10-07 16:36:08)

  版主，你好，我有个问题想问你，蛋白质相互作用有哪些方法，有没有高通量的方法，谢谢！
  
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  不少，譬如构建文库，很多种文库，多种筛选方法，要看你做什么，再决定用哪一种。

• ero11 (2013-10-07 16:37:02)

  正在做GST-pull down,请教以下问题：
  1，细菌裂解液和细胞裂解液的选择应该注意什么？我的bait蛋白目前研究不是激酶，prey蛋白可能是激酶有酶活性，这样的话蛋白裂解液应该如何选择？希望给推荐一下！
  2.在细菌中表达bait蛋白，诱导的量不太多，时间IPTG浓度温度条件都摸索过了，3-6小时差别不大，是不是形成了包涵体？如何优化条件？
  3.我用的是细胞裂解液与GST融合蛋白做binding实验，请问有没有较好的protocol？我们实验室多数是做TnT做体外的pull down,参考不多，亟待解决。
  4.接问题3，GST融合蛋白与细胞裂解液孵育的体系不知如何着手，用多少的蛋白裂解液合适呢？或者说多少的GSTbeads和多少细胞裂解液做结合？需要测蛋白浓度吗？
  
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  谢谢！！
  1.个人觉得最好两种BUFFER选用一样的最好。
  2.原核表达的重组蛋白，你确定是包涵体蛋白吗？如果是包涵体蛋白要蛋白变性溶解，之后再复性，使得蛋白复性为天然构象，对于有些蛋白来说，复性效果不是很好。如果重组蛋白在上清中就有表达，就可以直接做后续的PULL down实验了。
  3.pull down实验要做好，最好把对照设好了。如果对照设的不严格的话，结果就不设特别的可信了