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【求助】目的基因在大肠和酵母中都不表达？
【求助】目的基因在大肠和酵母中都不表达？
基因为1800多bp，最初是克隆到表达载体pPIC9K中，转化毕赤酵母GS115，提转化子的基因组DNA，经测序基因和读码框都正确，诱导发酵后跑SDS－PAGE，改变诱导条件后重复多次还是没有表达目的蛋白。
后又尝试原核表达，载体是pET30a，宿主菌BL21，酶切位点是Sal I和Not I，上游酶切位点Sal I后加了两个碱基以保证读码框完整，经测序基因和读码框也都是正确的，转化到BL21后用菌落PCR验证，劈出的条带大小也符合。然后就是摇瓶发酵，当OD600＝0.6左右时加IPTG至1mM，4小时后取样，超声破碎，分别取上清和沉淀跑SDS－PAGE，就是没有表达目的蛋白。
现在什么能试的方法都试过了，诱导物浓度、诱导时间、诱导温度、破碎缓冲液，甚至摇床转速都试过了，真是拿它没折了，请做过表达的有经验的大虾们分析一下，看看究竟可能是哪里有问题，万分感谢！！！
后来又克隆了另一个基因2400多bp，还是用pET30a，也没有表达。
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最新回复
bamboo16 (2014-5-27 15:50:25)
是膜蛋白吗？
remenb (2014-5-27 15:50:53)
蛋白的具体名称和特性说说。
lagua123 (2014-5-27 15:51:22)
QUOTE:
对细胞应该没有毒性lagua123 (2014-5-27 15:51:55)
这是蛋白电泳图，各位战友看看
目的蛋白大小应该在第一和第二条marker之间（从上往下），marker左侧一条是对照，再往左六条都是样品，好象和对照没什么区别。marker右侧两条是不加IPTG的样品，它在第一条marker位置(97kDa)比加诱导物的少一条带，如果这条带是载体上的，好象又太大了
83891468.snap.jpg
ero11 (2014-5-27 15:52:54)
首先，你表达的蛋白分子量比较大，至少应该有7万吧，所以表达的产物，久别指望有很多，酵母表达系统并不适合表达较大分子的蛋白。在大肠杆菌中表达量与宿主，质粒的稳定性，稀有密码子的多少，所表达蛋白性质等多种因素有关，建议你再换几种质粒和菌种试试。
lagua123 (2014-5-27 15:53:26)
QUOTE:
对，分子量大概7万。我查了一下基因里使用率在5％以下的密码子有26个，不知道算不算多。想把宿主菌换成rosetta试试看，谁有的能交换共享一下吗?
wood533 (2014-5-27 15:53:49)
>70KD 的蛋白质在大肠杆菌中有时很难表达的或者表达量很低的
INK (2014-5-27 15:54:18)
按照你的做法，你在你的目的蛋白N端融合上了太多的氨基酸了（好象大约有５０个左右），你的蛋白本来就大，现在更大了，如果你的序列中没有NdeI位点，你能不能尝试使用NdeI这个位点来表达看看呢？
lagua123 (2014-5-27 15:54:39)
QUOTE:
可以用，但是如果用NdeI位点，没有His Tag，纯化就比较麻烦了lagua123 (2014-5-27 15:54:57)
QUOTE:
还有一个办法：上游用NdeI位点，下游设计引物时去掉基因里的终止密码子，这样就在基因末端加上了His Tag，比在前端加His Tag要少40个额外的氨基酸，准备试试看！你觉得怎么样？？
wmp1234 (2014-5-27 15:55:32)
你是不是也考虑下western blot?
xyw5 (2014-5-27 15:56:15)
你的蛋白是不是有跨膜区，软件分析一下，如果有，去掉跨膜区
试一下低温，低速长时间在大肠杆菌里表达
lagua123 (2014-5-27 15:56:47)
QUOTE:
嗯，你的话又给了我希望这几天我正在做WESTERN，就是抗体稀释倍数不好掌握啊，His一抗还是蛮贵的，20微升就300多，还是国产的，试不起啊！请问你当时用的多大的？
lagua123 (2014-5-27 15:57:32)
QUOTE:
有跨膜区就会分泌到胞外吗？用什么软件分析，能不能介绍一下啊？
最低温已试到25度，210rpm摇过夜还是一样检测不到
bring (2014-5-27 15:57:48)
EXpasy网站上的DAS，在线的
我师姐好像用过18度过夜，上清表达了
lagua123 (2014-5-27 16:20:28)
查过了，不是膜蛋白!
基因上稀有密码子比较多，谁有宿主菌Rosetta，能否交换一下啊？
lagua123 (2014-5-27 16:20:49)
急求宿主菌Rosetta！可以交换
qhyu (2014-5-27 16:21:37)
我曾经做过二十多种基因在大肠杆菌中的表达,也表达过90多KD的蛋白,表达量也很不错
建议: 分子量大的不建议用pET30,通常会选用pET15
建议用低温诱导,曾经做过15度低温,诱导过夜,中途补加Amp,添加葡萄糖
疑问? 你的电泳是全菌电泳还是上清电泳
IAM007 (2014-5-27 16:22:15)
我觉得楼主的杂蛋白太多，不是很正常。
楼主是用哪种培养基培养表达的？
还有甲醇浓度是多少？这些都很有影响的
lagua123 (2014-5-27 16:23:02)
建议: 分子量大的不建议用pET30,通常会选用pET15
建议用低温诱导,曾经做过15度低温,诱导过夜,中途补加Amp,添加葡萄糖
疑问? 你的电泳是全菌电泳还是上清电泳
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好像pET15没什么特别的呀，就是His tag在N端。那用pET30也可以做到啊
我最低诱导温度是18度过夜，中途倒是没有补加过抗生素和葡萄糖，有区别吗？
电泳图是全菌电泳，超声破碎，上清沉淀全跑过都没有表达
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