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【求助】为什么我的扩增效率这么高？
这是我做的一个实时PCR的CDNA的标准曲线，5倍稀释度，可是反应效率却很高，达到137%，不知为什么，也没有引物二聚体，产物跑胶也只见单一条带。用的是sybrgreen mix,toyobo公司的产品。【求助】为什么我的扩增效率这么高？
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【求助】为什么我的扩增效率这么高？
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字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2016-2-06 09:59 作者: tie8 来源: 分析测试百科网
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最新回复
tie8 (2016-2-06 10:00:36)
这是融解曲线
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tie8 (2016-2-06 10:02:27)
这张是ct 值
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tie8 (2016-2-06 10:02:49)
32846702.jpg
tie8 (2016-2-06 10:03:13)
CT间隔小于一个cycle,所以导致曲线下压，删掉某些plot可以达到正常的反应效率。可是我这张图上感觉间隔似乎还比较均匀，不知该怎么解释。
就是加样枪不太准，反应体积偏大。不知跟这个有无关系。
tie8 (2016-2-06 10:03:29)
还有就是针对同一对引物，在同一种组织中取得的各个标本之间反应效率发现并不一致，不知这样的话如何通过标准曲线的反应效率来检测我的待测标本模版的初始数量。
079777chao (2016-2-06 10:03:46)
以5倍浓度梯度稀释的样本的Ct值的差异在扩增效率是100%时为2.32，Ct值差异是否相近（即扩增曲线间隔均匀），决定了相关系数R是否接近于1，Ct值差异大小则决定了扩增效率的高低。以5倍梯度稀释样本来说，Ct差异大于2.32，则扩增效率小于100%，差异越大则扩增效率越小。差异小于2.32，则扩增效率大于100%。你这次实验的Ct值差分别为1.88、1.73、2.19、1.57，差异明显小于2.32，所以导致扩增效率大于100%。
从你的描述来看，个人认为是你的加样枪不准导致梯度样本稀释不准确，即实际样本梯度小于5倍，估计介于2倍到5倍之间。
911 (2016-2-06 10:04:11)
tie8 (2016-2-06 10:04:33)
QUOTE:
不懂。能不能说的明白点儿。模板不纯按理应该减小扩增效率啊。moonlight (2016-2-06 10:04:54)
kuohao17 (2016-2-06 10:05:15)
双delta Ct法才需要计算扩增效率，标准曲线法是不需要的。
搞不懂大家为什么喜欢用双delta Ct法，是加样孔数少吗？但用此法时，为了计算扩增效率，也同样需要对标准品进行梯度稀释，至少三个梯度，也要同样扩增目的基因和内参基因，同样要做复孔。
而标准曲线法不需理会扩增效率，就算扩增效率不一致也不影响计算，梯度稀释5-6个梯度。相比双delta Ct法好像也多加不了几个孔。
新生上路，不知说得是否准确，请各位多指点！
tie8 (2016-2-06 10:05:42)
QUOTE:
我看文献上说，双delta ct法之所以被采用，就是因为考虑到不同基因的扩增效率不同而专门设计的，换言之，就是说如果你的内参基因和目的基因即便是处在同一个荧光域值上，但如果不考虑扩增效率而只单纯考虑ct值的差异性，那么还是不能准确估计cdna的起始分子数，因为他们的扩增效率（放大倍数）不同的缘故。所以引入扩增效率更精确一些吧。并且往往在ct值差异并不多的情况下，可以因为扩增效率的不同，最后算出的差异性却有天壤之别。cocacola (2016-2-06 10:06:01)
我今天第一次做real-time,也刚好遇到了楼主的这个问题，而且我的扩增效率更高，同一个模板，不同的引物，一个是180％，另一个是200％多，加样应该是准的，相关性0.99以上。也没有引物二聚体。是不是就是模板中抑制物含量高？该怎么解决呢？
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