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天生一对:CRISPR/Cas9与AAV

2015.7.30

   CRISPR/Cas9已经成为体外基因组编辑的最流行系统,但体内的基因编辑方法仍然受到Cas9导入问题的限制。腺相关病毒载体(AAV)因免疫原性低而常常用于基因的体内导入。不过,化脓链球菌(spCas9)和嵌合sgRNA(总共~4.2 kb)要包装到AAV载体中还蛮有挑战性的,因为AAV只能容纳~4.5 kb。尽管这种方法已被证明是可行的,但留给其他调控元件的位置也不多了。之前,张锋研究组将Cas9和多个gRNA包装到AAV载体中,提高了整体的包装能力,但必须纯化和共感染两个AAV。

  为了最大限度提高AAV的能力,Gang Bao的研究小组开发出一种分裂内含肽的Cas9,它可分在两个AAV表达框中,将更多空间留给调控序列和gRNA。不过,为了让Cas9和gRNA在一起,这个构建体必须更小。之前的尝试是使用来自嗜热链球菌的St1Cas9(~3.3 kb)和截短的Cas9。不过它们都有一些缺点:St1Cas9需要非常特异的PAM序列,限制了可靶定位点的数量,而截短的Cas9则效率要低得多。

  张锋研究组的Fei Ann Ran等最近也开发出一种新的策略来克服这些缺陷。为了发现更短、但同样有效的Cas9酶,他们分析了600多个Cas9的直系同源物,并发现这些分为两类:一类大约有着1350个氨基酸,包括SpCas9,而另一类则有着约1000个氨基酸。在那些较短的同源物中,只有金黄色葡萄球菌Cas9(SaCas9)在哺乳动物细胞中表现出切割活性。SaCas9产生插入/缺失,效率与SpCas9相似,这使得研究小组把精力都集中在SaCas9的研究上。

  CRISPR/Cas9基因组编辑的另一个缺陷是可能发生脱靶效应。为了比较SpCas9和SaCas9的脱靶效应,研究人员使用了一种称为BLESS的方法。利用这种灵敏的方法,他们发现SaCas9并没有表现出比SpCas9更高的脱靶活性,确认它适合体内研究。

  为了检验AAV-SaCas9在体内的效率,Ran等人利用肝特异的血清型AAV8创建了一个all-in-one的SaCas9和sgRNA构建体。由于CRISPR/Cas9的基因编辑效率随目标而异,他们检验了小鼠中的两个基因。对于这两个基因,他们在注射1周后都观察到插入/缺失的形成和表型的变化。小鼠肝脏在组织学上表现正常,与AAV-GFP对照相比,肝损伤标志物也没有增加。AAV-SaCas9-sgRNA不仅介导了基因组修饰,也没有引起明显的免疫应答。

  今年4月,研究小组在《Nature》杂志上展示了他们的成果。张锋表示:“我们的长期目标是将CRISPR开发为一种治疗平台。这种新的Cas9为扩大我们的Cas9清单,帮助我们构建出更好的疾病模型,鉴别出一些机制,以及开发出新疗法提供了一个支架。”

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