【讨 论】WB半年感悟

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• H2O (2014-3-07 16:07:20)

  
  晕倒 这么少的蛋白为什么不用化学发光液的方法来曝光呢？

• DDD (2014-3-07 16:08:44)

  
  实验室没人做WB，更别提ECL方法了。我连长什么样都不知道。。。
  后来别人推荐用BCIP/NBT方法来做，下面是我做的图片：
  条带出现在最上面一条M的下面一点~~~

  
  13157101.jpg

• DDD (2014-3-07 16:11:56)

  
  后来又被人推荐，用的红外激光扫描法来做，二抗很特殊很珍贵。这个方法据说比ECL方法还要灵敏，可是我的图片。。。
  左面那张膜的中间位置有隐约的黑色~~~可见蛋白的确是很少~~~~

  
  57773227.jpg

• DDD (2014-3-07 16:12:18)

  
  肯定很多战友会问我，为什么不提高蛋白量呢？对啊，我也很想提高，可是这个蛋白就是细胞天然表达的蛋白，不是我转染的不是我能控制的，试着增加培养细胞量来改变，可依旧是很少量，和原核表达的量根本不能比呀~~一个天一个地。
  一开始，磕磕畔畔地摸索了很长时间的条件，大分子量本身存在着电泳时间长转移时间长的问题。
  我都是100V，180MIN，效果很不错，转移后的胶基本上染不出什么条带了。
  然后封闭，一开始一直用的3%BSA，后来改用了10%小牛血清，缓冲系统也从TBS换成了PBS，也许这两者没有什么差异，或者某种程度上来说，BSA封闭会更好。但是也经常和大家交流，有战友就建议如果什么条件都换过还是不行不如试着改变一下封闭液，而在这之前我从来没想过封闭液会对抗体结合什么的会有影响，但也可以考虑试试。
  有时候来得及就先封闭1~2个小时，然后一抗4度过夜，有时候来不及就封闭过夜。两者没有什么差别。
  接着是二抗，DAB就用HRP标记的，BCIP/NBT就用AP标记的，买的博士得的，按说明书上比例稀释。
  用什么缓冲系统就用什么来稀释抗体。
  显色，很重要，自己觉得。一开始做的时候总有一不小心就背景很深，本来条带就弱吧就很容易被覆盖，就什么都看不清楚。可是微量蛋白显色有个讨厌的地方，就是要么就显过头，要么就时间不够显不出来，因为要靠肉眼来判断实在是很困难啊~~~~~
  哎~~~~这么做啊做的，也已经半年了。有时候嘲笑自己，闭着眼睛都能把WB给做完，因为一直在做，太熟练太程序化了~~~~老板还总说我手法有问题，技术不过关，可我却能帮师姐表达的原核蛋白给做出来， 老板也给不出什么实质性的意见啊，他们会把实验想得太理想化，总觉得结果应该是条带清晰没有背景的，所以我那样的结果到老板那里都会被贬得一文不值。。。
  很郁闷，蛋白也不是我生的，就那么点量你怎么做出超越它的条带呢？不知道有没有和我一样做如此之少的蛋白的战友？
  也请各位战友多多指教~~

• 8princess8 (2014-3-07 16:12:42)

  
  通常情况下，内源性蛋白表达量低是很正常的现象，你不能指望每个蛋白都像Actin一样。原核蛋白能做出来不能说明任何问题，因为如果你做试验更久一点，你会发现当一个蛋白表达量过高的时候，其实抗体是什么已经无所谓了（我可以用我们拥有的大部分抗体标记封闭用的BSA）。
  当表达量过低的时候没什么好抱怨的，我做的蛋白全部考染不出来（这就是我反对考染，反对立春红的直接原因，你染出来的并不是你的目的蛋白，更多的时候只是那些表达量高的杂蛋白），解决的方法，要么换更好的抗体，要么用IP富集。
  既然你的目的是检测你制备的单抗，那通常这种情况下，你的单抗应该是很多很多了，哪么太easy了，做IP再IB。
  不要把IP想得太难（尤其这种），其实非常非常easy。取个0.5-1ug加到你的sample里面（cell lysis，不能是那种直接用loading buff.裂解的sample），4度翻转半个小时，然后取BSA预blocking的protein A beads，吸附半小时，washing，Glycine-HCl elute（pH3.0）。然后elute样品跑WB，你要是嫌浓度还是不够，你就把sample体积加大，总之抗体和beads固定下来总能得到你想要的富集的高浓度WB sample，除非你的单抗本来就不行，或者空间构象变化太大不能做IP。Negative ctrl用beta-Actin好了，呵呵，我们beta-Actin是鼠抗的或者别的只要是鼠抗的一抗都可以做ctrl。
  另外，不用ECL我想你还是放弃吧，DAB灵敏度绝对不够，至于那个什么红外扫描的，既然二抗特殊不好普及，就不用呗。ECL是目前最常见最通用的方法。
  PS：其实我不太相信你所谓的蛋白表达很少，你只是凭你的经验的主观判断，我更加怀疑你制备的单抗可靠性。你可以用商品化的抗体试试。

• DDD (2014-3-07 16:13:00)

  首先，谢谢楼上战友如此细节的解答~~
  学习到了很多东西，不过我用的这个抗原的确表达量很低，考染胶几乎都看不见的，当然分子量是已知的。尽管蛋白量低可是却有异常的活性，所以值得我们去研究的。
  至于我自己制备的单抗可靠性，~~~~正是想通过WB来验证的，所以还必须跨越这一步呢~
  你说的免疫沉淀方法我没做过，但是这种方法应该是抗体和天然蛋白的结合吧？可我的单抗是用的线形肽来免疫的，可能不能和构像的蛋白结合，WB是不是更适合一些呢？

• NBA (2014-3-07 16:14:15)

  
  呵呵，首先指明你的误区，很多抗体都是用多肽免疫构建的，但仍能与天然蛋白结合，所以到底能不能结合，可能要考虑蛋白本身的折叠，如果你很清楚你的蛋白构象如何，不能结合也是可能的。
  其次免疫沉淀是为了提供一种最简单、最经济的富集蛋白的方法，当然TCA比较经典，但是想来你不是先分离纯化，那么TCA沉淀后可能蛋白浓度过高，不能溶解，起不到富集抗原的作用。
  在上个回答里面，我首先想让你证实抗原到底表达量丰度如何，这个用商品化的抗体可以做到。（如果你打算卖抗体，还可以当成标准品对照）
  其次，对于你自己构建的抗体，要么是提升一抗浓度以达到WB能识别的阈值；要么就是通过IP富集抗原再连带WB，用IP的产物做WB sample。所以“WB是不是更适合一些呢”，似乎你没有理解我的回答。
  WB最大的孔（我用过的）能上50ul吧，但是你可以用IP富集10ml cell lysis所有目标抗原，elute in 15ul for WB testing，这不就简单的放大200倍！？即使你制备的抗体不能做IP，商品化的抗体中总有可用于IP的，对不
  PS：还有就是能不能通过刺激影响抗原的表达也是一个可以考虑的策略
  如果你的目的单纯为了检验抗体，你还可以通过GST表达抗原实现丫；当然我猜测你是为了检测天然组织或细胞中的内源蛋白，这仅仅是一种最不可能的建议。

• DDD (2014-3-07 16:15:14)

  
  首先还是依然感谢你的耐心指导：）
  本来老板也考虑让我做IP，但是由于事先无法知道到底抗体能否识别天然抗原，所以想先用IFA的方法来验证一下再做IP。
  至于商品化的抗体，当然是没有啦~不然为啥要做呢？：）
  但是老板还是希望我先把WB的结果做得清楚些，有说服力才能进行下一步的实验，所以这个坎不迈过去。。。。
  我都做了半年了：（（（
  今天还试着用ECL的方法，没有曝光拍照只是肉眼看了一下，结果整个膜都是荧光啊~~~~分辨不出条带，不知道是为什么！！！：（（

• NBA (2014-3-07 16:15:49)

  
  这种情况我以前分析过，多数情况是一抗无效，二抗随机结合。
  我想一般只要是封闭>=0.5hr；二抗1：5000，1-2hr左右；其间漂洗过程有>=3 times，washing buff.含Tween 20，这些条件具备的情况下，基本上可以认定是一抗无效或者效价极低。
  排除封闭的原因是，最短5min的封闭足以进行WB，我相信你一定比这个时间长；
  二抗时间一般都不会过长；通常洗液都含有Tween 20；我想做过半年WB不至于在这些基本问题上还有疏漏。
  当一抗无效的时候，二抗与膜上每个位点碰撞和结合的几率相同，则整张膜都是相对均一的背景信号，膜边角处可能稍微挂的二抗多、有些亮点。

• shenkunjie (2014-3-07 16:17:26)

  恕我来多几句嘴。nba是个懂行的人。我认为她（他）的意见很有价值。
  关于封闭，我的意见是用5％的脱脂奶粉，RT，1～2h，效果很好。

• fsdd817 (2014-3-07 16:18:10)

  我是一个新手，想请教一下，在做WT时，用的抗体浓度1：200（商家推荐是1：200~1：1000），结果出来的蛋白的量的信号就很不明显，而膜本身的信号很强，我不知该采用什么样的补救措施，请教各位高手，谢谢

• remonte (2014-3-07 16:18:33)

  
  背景高时, 应采取如下解决办法:
  1. 加大抗体的稀释倍数;有时候你可能觉得已经很稀了,但你还是稀释的不够. 大胆稀释吧!!
  2. 改变封闭液的配方;
  3. 用封闭液抗体;
  其中最有效的办法是1.
  另外, 楼主应首先做的是ELISA 或DOT BLOT,尤其应做用电泳缓冲液处理的样品的DOT BLOT,以确定能否用你的单抗做WB. 原因有的战友已讲述一二,在此不再详述.
  请一定循序渐进,方能成功.

• ending (2014-3-07 16:18:56)

  我是一个新手，想请教一下，在做WT时，用的抗体浓度1：200（商家推荐是1：200~1：1000），结果出来的蛋白的量的信号就很不明显，而膜本身的信号很强，我不知该采用什么样的补救措施，请教各位高手，谢谢
  我的意见是：
  1、把一抗按照1：500或1：800来稀释
  2、加大你的上样量，因为你连自己的目的条带都看不见，就算光线很强，我觉得很能看见一点的
  3、增加洗膜的次数和时间
  个人意见，仅供参考

• bamboo16 (2014-3-07 16:19:20)

  
  对LZ我还有一个建议，可以用孔径比较大的超滤膜，先将蛋白浓缩数倍，然
  后用ECL显影。如果你不太清楚自己的抗体是否可以，可以先用该细胞的其它蛋白已有的抗体做做，如果可以的话，再检测你要检测的抗体。这样应该更可说明是什么问题。

• fsdd817 (2014-3-07 16:20:43)

  谢谢，我又洗了5次，每次5分钟，但是效果还是不明显，目的条带还是不明显，只能隐隐的看到一点，再重新做一个加大稀释量吧，希望这次能行啊，谢谢

• hustwb (2014-3-07 16:22:38)

  
  先富集目的蛋白。如果没有条件做IP。那么其它富集的方法很多，比如离子交换层析，疏水层析，超滤，盐析等都行。
  楼主说目的蛋白活性很好，那么肯定有测活性的方法。争取把蛋白溶液的比活性提高100倍再做WB，我就不信它不出来
  

• guagua (2014-3-07 16:22:59)

  我前面定的santa cruz 的抗体 说明书上有说4°保存 但是有个老师把我的冻到了-30 不知道还能不能做出来

• NBA (2014-3-07 16:23:18)

  问题从来没有那么绝对的，抗体忌讳的是反复冻融，而不是一两次的冻融；冻融无非是剪切力对蛋白的破坏。通常不会冻一两次就会导致完全失效，但是原始抗体通常冻融一两次效价会损失很大。所以应该还是能用的，只是效价可能会下降一些，反正抗体的最适稀释比对不同的人的操作还是有不同的，要摸索。如果标记不出来，无操作问题外，就是抗体本身不行，scbt很bt
  此外，抗体的保存问题，其实以前我也回答过。
  两种方案：
  1. 分装。每次一管，但是可能太多占地方，而且还会有粘壁的损失，不是很推荐。
  2. 1：1加甘油，冻于-20度，可长期保存，此方法实际上也被很多国内的试剂公司广泛采用，诸如博士得，中杉，它们小包装的进口抗体通常都是1：1添加甘油保存于-20（不信去查查）。值得注意的是：不是所有的抗体都可以1：1添加甘油，要以抗体说明书为准，如果说明书中本身存在甘油，或特殊注明外，通常可以采用。

• DDD (2014-3-07 16:23:58)

  
  最近忙得做实验，做啊做，都没空来看自己的帖子。
  感谢各位战友的“七嘴八舌”！学习到很多东西
  觉得NBA肯定是个经验丰富的老师吧~说话很专业很细节。恩，我想过自己做的一抗的无效，不过做DOT-BLOT的时候，还是可以做出结果来的。不过抗原用的是免疫的多肽，而不是细胞天然表达的蛋白。
  后来又做了一次，还是膜很亮，曝光出来的片子是黑的~~~天啊~~~我要疯了！
  但是我做的时候是有对照的，这个对照的抗体已经证明是可以和蛋白结合的，可最后也是一片黑~所以我想目前还不能说到底是不是抗体的无效问题，因为似乎是实验本身就没有作好的原因。如果曝光出来，对照有条带，而样品抗体无条带才能说明抗体本身的问题吧。
  我决定还是加大洗涤的力度，多洗洗~~~