【求助】western 湿转恒流好还是恒压好？

最新回复

• hold住 (2014-5-20 11:05:53)

  1、湿转一般恒流恒压都可以，没有优劣，BIO-RAD 说明书上如恒流，转膜一般350mA 70min,恒压 100V 90min
  2、应该不是恒压或恒流的关系，你这种情况很可能是你的滤膜、凝胶夹或你的膜气泡没有赶净等原因造成，注意检查下滤膜，如已经变薄，需要换张

• gogo (2014-5-20 11:07:04)

  
  我的蛋白分子量是43KD，需要什么转膜条件阿

• S6044 (2014-5-20 11:07:24)

  
  如果一直有个不行，那么可能有个电转装置或其配置东西出了问题，和两种方法无关。

• hold住 (2014-5-20 11:07:47)

  
  蛋白分子量是43KD恒流，转膜一般350mA 70min,恒压 100V 90min 足够

• vera+ (2014-5-20 11:08:05)

  
  我今天转膜恒压80V 120min ，转膜后丽春红染色还行，可是转膜电流不到100 mA ，难道我的转膜电流太小么？是否有问题呢？我是同时转了两张膜，用的是PVDF膜

• wood533 (2014-5-20 11:09:04)

  蛋白分子量是42KD和15KD,转膜用恒压80V,2h可否?
  
  没有问题。其实转膜不一定非要很完全才能进行WB的后续步骤，立春红染过后看到有条带就可以，后面一样可以反应。
  你湿转时是两个膜并排（可以说串联吧）放置在两个电极之间的么？那样势必不能两个转的完全一样，我做过，总是一个多一个少，好像是靠近阴极的那个转的快些。
  
  [ 本帖最后由 wood533 于 2014-5-20 11:10 编辑 ]

• xue258 (2014-5-20 11:10:48)

  
  我的目的蛋白２００ＫＤ左右，请问什么样的湿转条件比较好啊？多谢．

• 蒲公英 (2014-5-20 11:12:58)

  我是在一张膜上先转,然后在孵育时再把膜剪开,分别加一抗.

• S6044 (2014-5-20 11:13:18)

  
  我一般湿转都喜欢用恒压,一般是30-40V过夜转,60V 3-4h,100V 1h.
  其中我最喜欢过夜转.

• 喇叭花 (2014-5-20 11:13:42)

  
  在下的经验:
  蛋白分子量是43KD, 110V, 30-40 min 足够;
  ２００ＫＤ左右，25-30 V OVERNIGHT

• gogo (2014-5-20 11:14:08)

  我是在一张膜上先转,然后在孵育时再把膜剪开,分别加一抗.
  
  ==============
  
  完全可以啊

• kulee (2014-5-20 11:14:52)

  
  我的蛋白分子量是10kd，请问用什么样的转膜条件比较好啊，谢谢

• 木槿 (2014-5-20 11:15:12)

  
  我的目的蛋白是26KD 和17KD 请问如果用半干转的话,分别应该是什么条件下转?
  另外我听说转膜也跟膜的孔径有关系?我用的是NC,是不是转漏了？我前两次分别用250mV 3h和12V 1.5h试过,但是没有目的条带.是没转上还是转过了? 我用半干转.
  目前总是检测不出我的目的条带,很是着急.
  恳请高手指教!!!
  谢谢!!

• 木槿 (2014-5-20 11:15:49)

  
  再请教一个问题:
  我已经发光过的NC膜,能不能用TBST洗了之后,接着再次加我的另外一种一抗,接着western检测另一种蛋白?上面说过了,我的目的蛋白是26KD 和17KD 两个.还是需要处理一下??如果需要处理应该是什么液?配方是什么?
  请大家帮忙,不胜感激!!

• 3648755 (2014-5-20 11:16:11)

  QUOTE:

  原帖由 木槿 于 2014-5-20 11:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  再请教一个问题:
  我已经发光过的NC膜,能不能用TBST洗了之后,接着再次加我的另外一种一抗,接着western检测另一种蛋白?上面说过了,我的目的蛋白是26KD 和17KD 两个.还是需要处理一下??如果需要处理应该是什么液?配方 ...

  应该用抗体洗脱液处理后，再加另一种一抗才行。
  抗体洗脱液的配方(15ml体积)：β－巯基乙醇 0.11ml
  10%SDS 3.0ml
  1.26mol/L Tris(pH 6.8) 0.75ml
  DDW 11.14ml

• 66+77 (2014-5-20 11:16:31)

  
  我也转43kD的，80V恒压1h，电流一般在160左右。

• JK.jon (2014-5-20 11:16:55)

  再请教一个问题:
  我已经发光过的NC膜,能不能用TBST洗了之后,接着再次加我的另外一种一抗,接着western检测另一种蛋白?上面说过了,我的目的蛋白是26KD 和17KD 两个.还是需要处理一下??如果需要处理应该是什么液?配方是什么?
  请大家帮忙,不胜感激!!
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  不用洗脱液也行的.可以用TBST洗后,再封闭过夜,加另外的抗体.我这么做过,是可以的!

• 7437654 (2014-5-20 11:17:20)

  
  你好：我的BIO-RAD 半干转膜，上面写着电压不能超过25V啊，为什么你们所说的电压有那么大啊？

• any333 (2014-5-20 11:17:41)

  
  我做过分子量是44KD的，采用湿转，恒流400mA，转1小时，效果不错。

• ROSE李 (2014-5-20 11:18:09)

  
  转膜转的不好，建议换一下glycine试试，很多国产的glycine都有问题。其实多转或少转十几分钟问题不大。