【求助】寝食难安的几个Real－timePCR问题

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• jude (2016-2-06 10:07:09)

  
  看来你还没有把SDS软件研究透。
  1、用TaqMan探针的话可以放在一起，用Sybr的话只能分开了，可以先将一个设为Standard，另外一个设为Unknow，做完PCR后，分析一个基因后，再通过SDS软件，将Standard和Unknow互换，分析另外一个基因。
  2、个人认为肯定需要做重复的，至少3个，重复的标本起同样的名字，软件就会自动求平均值做曲线，应该是安照每个梯度的平均值做曲线，但是标准曲线图上会出现15个点。也可以将这15个Ct值导出，自己做曲线。
  3、ABI7500做标准曲线不一定要5个梯度，可以6个，7个都可以，只要在分析范围之内就可以，也可以先做上10个梯度，做完后，再根据扩增曲线，通过SDS软件将不需要或不好的点去掉，保留比较理想的梯度范围。
  搞科学首先要把用的东东研究透才能更好的发挥它的价值。

• 西子 (2016-2-06 10:07:31)

  我将继续努力弄透SDS软件！！另外还有一个问题向大侠们请教：
  我用PRIMER EXPRESS设计了一对引物和探针，引物通过普通PCR（25ul体系）、测序验证完全正确，但是加上探针就扩增不出来了（50ul体系），不晓得是什么原因？上下游引物，探针长度：25---22---26bp，GC含量：百分之48---54.4---57.7，TM值：59--58.3--69.6
  普通PCR体系25ul：目的片段96bp
  10xpcr buffer－－－2.5
  dntp－－－1ul
  taq－－－1ul
  F－－－1.25ul（10uM）
  R－－－1.25ul（10uM）
  cDNA模板－－－4ul
  水－－－14ul
  反应条件：94－－－3min
  94－－－50sec
  60－－－30sec
  72－－－15sec
  72－－－10min
  30cycles
  换成一步法Q-PCR后就扩不出来，难道我需要再在50ul体系下摸索好了条件再把探针加上去吗？因为我做的50ul体系是以前师姐摸索好的，我只是为了提高该方法的灵敏性和特异性才自己设计的引物和探针，目的片段长度及引物探针的TM值都与以前师姐设计的相近，所以认为沿用她的体系我觉得应该不会有问题的，请大侠们指教

• jude (2016-2-06 10:08:09)

  如果用PRIMER EXPRESS 3.0默认参数设计的引物，Tm值基本都在60度左右，不会差太大，并且如果是普通TagMan探针的话，探针引物Tm值应该比引物的Tm值要高一点点，这样在退火时探针优先与模板结合，你的引物似乎不太符合这个原则。TagMan-MGB探针没有分析过，单纯探针序列要短，Tm值也要低，加上MGB就不知道了。
  我曾经分析了一下PRIMER EXPRESS 3.0设计的引物，有时有很严重的发卡结构，但是评分还很低（这个软件分越低越好），我觉得还是关键在于要配合ABI的试剂合，ABI的Gold Taq是数一数二的，基本上用PRIMER EXPRESS 3.0设计的引物，加上ABI的试剂合，加上ABI7500默认反应条件，基因只要有表达，都能扩增出来，ABI似乎努力将其做到傻瓜化。
  曾经也摸索过扩增效率，结果几个基因都在100％以上，并且相差不大，后来就没有再做，将PCR产物设计在150bp以下，用ddCt方法来做，结果还是不错的。
  关键还是Taq，Taq影响其扩增效率，不同公司产的Taq及其buffer的确不太一样，一分钱一分货。

• 西子 (2016-2-06 10:08:31)

  我用的是2.0的，我的探针比上下游引物高出10度，难道你的意思是太高了？不会吧？普通Taqman就是要这样的设计啊！我用的退火和延伸一个温度：60度，而探针的TM值是69.6肯定能退火，并且先于引物结合上去啊，引物我验证了是没有多大的问题，探针自身也没有多大问题，问题可能存在于引物于探针之间？我用PP5检查了一下，虽然有发夹，dimer，cross dimer等，但是引发的效率抖很低的。deltaG的绝对值很少有超过10的，我用的虽然是普通的Taq酶，但是师姐的同样体系，同样条件也扩增得很好啊？

• jude (2016-2-06 10:08:54)

  呵呵，不好意思，看错了，上面的Tm值，以为中间是探针的。
  不知实验时有没有做对照，阳性对照，阴性对照，这样出了问题才好分析，实在不行就让你师姐做一下，看看她做的如果。
  PCR这东西说简单也简单，说复杂，也够复杂的，我相信很难有人说自己是PCR专家。

• 555444 (2016-2-06 10:09:11)

  我来提几点建议：
  1：确认用你师姐的引物探针做过对比实验，这样可以确定反应体系没有问题。
  2：保证CDNA的质量，可以构建一个质粒，用质粒考核体系。
  3：你的退火温度用的是60度，从你引物TM值来看，两步法时60度应该高了些，你可以试着降退火温度，比如做58度和55度。
  4：如果降退火温度还是出不来，那么做完Real－timePCR后跑凝胶电泳。用你师姐相同CT值的产物做对比，用凝胶软件分析产物情况，如果产物对比没有问题，那么问题出在探针上，你探针GC含量为57.5%，应该没有问题。你核对一下设计序列无误后就可以和合成公司的技术人员交流了，这种情况大部分是探针的合成质量不好。
  供参考，祝实验顺利！

• 西子 (2016-2-06 10:10:38)

  答1：以做，确定体系没有问题（只是可能要优化）
  答2：我做的是RNA，一步法，只能用RNA做模板，采用的是大量提取后稀释混匀的策略。
  答3：60度没有问题，不管是25ul还是50ul，普通PCR我都用的60度，扩出目的条带。
  答4：我们做完Real－timePCR后不让开盖跑凝胶电泳，避免气溶胶。
  最后我采用很傻的普通一步法RT-PCR的条件跑出曲线，不过很丑
  反应条件：
  42度－－－20min
  94度－－－3min
  94度－－－50sec
  60度－－－30sec
  72度－－－30sec
  40cycle
  60度收集荧光
  曲线如下，请大侠们给点意见，跪谢！

• 西子 (2016-2-06 10:12:00)

  
  Realtime－PCR扩增曲线

  
  70841709.snap.jpg

• 555444 (2016-2-06 10:12:29)

  呵呵，看了这张图，我怎么感觉仪器有问题
  首先：从图上可以看出扩增效率不高，没有明显的指数期，从我做过的优化实验来看，降低退火温度应该会有帮助，电泳pcr和实时pcr并不等同，电泳pcr在60度退火可以得到很好的产物，但是在实时pcr时，你引物的退火温度仅为58.3，很有可能导致引物和模板结合不稳定，也就导致没有明显的指数期。（不知道在你的实验室中，针对你的rna有没有其它跑的很好的引物探针，有的话，用他们的引物探针检测模板数，会更有利于结果分析）
  其次：试着优化反应体系，我这里提供一组基础试剂，你可以试一下，试剂均为终浓度
  Tris-cl（PH9.0)--20mM
  Kcl----------------50mM
  Mg---------------1.75mM
  EGTA------------0.25mM
  TMA-------------1.5mM
  Taq--------------2u
  dNTPs------------0.2mM
  引物浓度:各500nM
  还有：你可以做下探针梯度

• 西子 (2016-2-06 10:12:52)

  我也是感觉机器有问题，但是也有曲线做得很好的时候，只是时好时坏，也就只能怪自己的操作问题了。
  上图体系终浓度分别为:
  10Xpcr buffer含：
  Tris-cl（PH8.4)--20mM
  Kcl----------------50mM
  Mg----------------2mM
  Taq----------------------------------2U
  dNTPs-------------------------------0.2mM
  引物浓度--------------------------各500nM
  探针－－－－－－－－－－－0.15um
  跟你推荐的除Mg+外，其他的差不多
  然而：
  1、我没有用过您提到的EGTA、TMA，说实在话，我连这是什么都不晓得，还望huanglinjoe赐教！！
  2、有结果看来体系的问题不是很大，关键是反应条件的优化

• 555444 (2016-2-06 10:14:55)

  不用那么客气，我也是在学习中，只是最近做了一些引物探针的优化实验
  1：既然认为仪器有点问题，那么可以和其他使用同一台机器的同学交流。认为机器确实存在问题，有必要让机器提供方的技术人员调试仪器，确保机器不存在任何问题。
  2：EGTA、TMA都是real-pcr反应体系中的增强剂，是我的老板摸索出来可以增加pcr特异性的添加剂，同时，也可以增强扩增效率。
  3：在体系优化中，可以再合成几对引物，这是效率不高的根本解决办法（有必要时得重新合成探针，当然，这样成本会比较高）有时你认为这一对引物好，各个方面都分析，觉得很好，但是效果就是不好。推荐你和上海基康技术人员联系，他们可以帮忙免费设计引物，服务态度也很好，有需要的话我可以给他们的联系方式。
  4：对于体系优化，我是这么做的：
  配置Tris(8.0-9.2)-------------0.5M
  Kcl------------------------1M
  Mg-------------------------0.25M
  各种添加剂--------------适宜浓度
  稀释的引物探针
  一般都是从PH做起

• 西子 (2016-2-06 10:16:13)

  我用ABI7500自带的Primer Express2.0艰难的设计了一对引物和探针，主要是现在GeneBank中的目的物种序列太多（34条）加上还有相近种属的干扰，即要找到目的物种的保守区，又要避开相近种属的同源区，再加上Taqman引物和探针设计的一些苛刻要求，我花了整整2天时间，又是Primer Express2.0，又是DNAMAN,又是DNASTAR，又是Oligo，又是PP5,又是BLAST,还加上大量的手工选择（数CG个数，C>G, 数上游引物3‘端距离探针5’端的距离等等），废了N牛N虎之力才从大量的候选组合中，选到两条比较符合要求的东西，但是也并非十分完美，探针跟有几个模板还是有1个碱基不匹配，（还好，离3’端有8个碱基），在探针合成之前对上下游引物进行普通的PCR，结果非常理想（特异性，敏感性），并且测序完全正确，所以就将探针合成回来（上海基康），附上我的引物和探针设计图，希望大侠帮我看看
  上游引物：F4－－－59度
  下游引物：R4－－－58.3度
  探针：T4－－－69.6度
  R4FXFB表示R4反向互补
  333000是模板
  目的序列96bp
  另外一问：探针能设计简并碱基吗？理论上探针设计好了，是可以多设计即对引物来筛选，但是必须保证
  1、上下游引物在34条以发表序列的保守区（敏感性）
  2、避开同属同源区（特异性）
  3、上下游引物TM值相近且在60度左右（因为探针在70度左右）
  4、目的片段长度约100bp（为了保证与同管扩增的内参长度差不多，减少长度相差太大引起的效率差异－－deltadeltalCT值发要求两者效率一致）
  5、引物自身设计还有的要求（发夹，错配、dimer等）
  哎！难！

• 西子 (2016-2-06 10:20:27)

  引物，探针和模板！！！

  
  41929174.jpg

• dotaaa (2016-2-06 10:21:04)

  看来你还没有把SDS软件研究透。
  1、用TaqMan探针的话可以放在一起，用Sybr的话只能分开了，可以先将一个设为Standard，另外一个设为Unknow，做完PCR后，分析一个基因后，再通过SDS软件，将Standard和Unknow互换，分析另外一个基因。
  2、个人认为肯定需要做重复的，至少3个，重复的标本起同样的名字，软件就会自动求平均值做曲线，应该是安照每个梯度的平均值做曲线，但是标准曲线图上会出现15个点。也可以将这15个Ct值导出，自己做曲线。
  3、ABI7500做标准曲线不一定要5个梯度，可以6个，7个都可以，只要在分析范围之内就可以，也可以先做上10个梯度，做完后，再根据扩增曲线，通过SDS软件将不需要或不好的点去掉，保留比较理想的梯度范围。
  搞科学首先要把用的东东研究透才能更好的发挥它的价值。
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  最近在做QPCR的相对定量实验，发现ABI7300不能做相对定量，丁香园中查了资料发现ABI7500可以做相对定量。于是现在打算用7500做。我的目的是要做标准品、待测样品的目的基因和内参基因。然后得到两条标准品的目的基因和内参基因的两条标准曲线。通过标准曲线得到待测品在目的基因，内参基因的CT值，然后得到待测品在目的基因，内参基因的拷贝数。从而得到其相对比值。
  1 但是看了一些人的帖子说ABI7500相对定量不出标准曲线？是真的吗？ 如果是的话，那怎么样才能得到双标准曲线， 怎样才能继续我的实验？？
  2 看了一些帖子说相对定量可以在ABI7300绝对定量下做：可是这样 做 只能得到一条由标准品的目的基因和内参基因组成的标准曲线，不能分别得到两条标准曲线？ 那怎么做相对定量？？
  3 另外，我至今仍有疑问，我目前倾向的方法是相对定量，但是如果我 把标准品准确稀释，待测样品的浓度也准确测定，是不是就可以用绝对定量的方法来做，不需要内参？因为我所有的待测DNA和标准DNA都是从血里面提的。没有表达差异？
  求高人赐教！！非常困惑中！！

• woshi (2016-2-06 10:21:20)

  
  1、在ABI7500上做相对定量，如果用标准曲线法来做的话，就可以有标准曲线，如果用2-ddCt方法来做，就没有标准曲线，关键是你要采用什么方法做相对定量。如果用标准曲线法来做相对定量的话，要采用软件上的标准曲线实验方案，设定标准品参数，就可以得到标准曲线，有几个基因（包括内参）就有几个标准曲线，再通过相对定量的统计计算方法，得到相对定量关系。
  2、7300与7500没有太大差别，做法和7500是一样的。
  3、采用相对定量还是绝对定量要根据你的实验目的来选择，例如检查细胞或组织内本身基因的表达，多用相对定量，如果不用内参的话，反而不准确；如果检测细胞或组织外源基因的表达，例如血液里面乙肝病毒，这些实验反而不好找内参，所以，只能定标本来源总量，例如1ml血液感染的乙肝病毒的拷贝数等，必须采用绝对定量。